陈春莺，刘志辉，钱 芳，陆 超

（江苏省中医院，江苏 南京 210029）

清热养心颗粒由金银花、黄连、酒黄精、百合等组成，具有清热解毒、养心安神之功效，临床用于治疗热毒侵心、气阴两伤、心神失宁的病毒性心肌炎急性期以及合并心律失常、心悸胸闷者。本研究通过正交试验确定其最佳提取工艺，报道如下。

1 仪器与试药

Waters515型高效液相色谱仪，Waters2487型紫外检测器；ZW色谱柱恒温箱（中科院大连化学物理研究所）；Empower色谱工作站；手动进样器，20!L定量环；BP-211D型1/10万电子分析天平（德国Sartorius）；KQ-1000E型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；101-1A型电热鼓风干燥箱（南通沪通制药机械设备厂）；HH-4数显型恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）。绿原酸对照品（含量测定用，批号为0753-9910，购自中国药品生物制品检定所）；高效液相色谱所用试剂为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯；所用中药材均购自江苏省药材公司，并由本室专家鉴定。

2 方法与结果

2.1 正交试验因素水平选择

取处方量药材，选用正交试验表L9（34），3因素分别为加水量（因素A）、提取时间（因素B）、提取次数（因素C），因素水平表见表1。

表1 因素水平表

2.2 水提取得率

精密吸取各样品溶液3 mL，水浴蒸干，置105℃烘箱中干燥3h，取出，置干燥器中冷却30min，取出，迅速称重。

2.3 正丁醇萃取得率

精密吸取各样品溶液30mL，加水饱和的正丁醇萃取3次，每次20mL，合并萃取液，水浴蒸干，置105℃烘箱中干燥3h，取出，置干燥器中冷却30min，取出，迅速称重。

2.4 绿原酸含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱：SupelcoODS柱（250mm×4.6mm，5!m）；流动相[1]：乙腈-0.2％磷酸溶液（10∶90）；检测波长：327 nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：20!L。

2.4.2 溶液制备

精密称取绿原酸对照品15.05mg，置棕色量瓶中，加50％甲醇溶解制成每mL含绿原酸301!g的对照品贮备液，用50％甲醇稀释至30.1，15.05，7.525，3.762 5，1.881 3，0.940 6!g/mL质量浓度的对照品溶液。分别吸取相当于金银花药材0.05 g的正交试验提取液，置50mL容量瓶中加50％甲醇至刻度，用微孔滤膜（0.45!m）滤过，滤液作为供试品溶液。

2.4.3 方法学考察

标准曲线绘制：分别精密吸取不同质量浓度的对照品溶液各20!L，注入高效液相色谱仪中测定。经线性回归，得绿原酸回归方程Y=67 848X-29 318，r=0.999 7。结果表明绿原酸质量浓度在0.940 6～30.1!g/mL范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

精密度试验：精密吸取同一对照品溶液20!L，注入高效液相色谱仪，重复测定5次，以峰面积计算，RSD为1.99％。

重现性试验：取同一批次6份样品，进行平行试验。结果的RSD为1.85％。

稳定性试验：取同一供试品溶液，按上述色谱条件，于0，2，4，6，8，12h分别进样，测定色谱峰面积。结果 RSD为2.15％（n=6），表明供试品溶液在12h内稳定。

加样回收试验：取已知含量的同一批次6个样品，分别加入绿原酸对照品，测得平均回收率为97.83％，RSD为1.04％（n=6）。

2.5 正交试验结果

根据L9（34）正交试验表进行试验，分别测定提取液中绿原酸量、正丁醇萃取得率和水提浸膏得率。绿原酸量为水煎提取正交试验的主要考核指标，同时将正丁醇萃取得率和水提浸膏得率作为水煎提取正交试验的考核指标，权重系数分别定为0.7，0.2，0.1。把绿原酸量 Y1（g）、正丁醇萃取得率 Y2（％）、水提浸膏得率Y3（％）最高者定为100，其余按公式Y′1= Y1i/Y1max×100，Y′2=Y2i/Y2max×100，Y′3=Y3i/Y3max×100，计算相应得分，再按公式Y=0.7Y′1+0.2Y′2+0.1Y′3计算综合评分作为筛选指标。结果见表2。

表2 水煎提取正交试验结果表

2.6 方差分析

方差分析表见表3。由方差分析表和正交试验结果可以看出，因素A对试验结果有显著影响，因素B、因素C对试验结果没有显著影响。因素A相对其他因素影响较大，各因素影响大小次序为A＞B＞C；各因素不同水平的影响大小次序为A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1。因此最佳提取工艺为A3B3C3，即每次加水10倍，每次煎煮60min，煎煮3次。考虑到工业生产的实际和节能，优选工艺为A2B3C3，即每次加水10倍，每次煎煮60min，煎煮2次。

2.7 验证试验

称取与正交试验等量药材3份，按优选的提取工艺提取，测定各指标成分含量。结果平均浸膏得率为33.12％，平均正丁醇萃取得率为3.77％，绿原酸平均含量为114.29mg，所测得平均绿原酸含量、平均浸膏得率和正丁醇萃取得率接近正交最高量，故优选的工艺可行。

表3 方差分析表

3 讨论

参考2005年版《中国药典（一部）》金银花药材项下方法[1]，分别以不同比例的乙腈-0.2％磷酸溶液为流动相，结果乙腈-0.2％磷酸溶液（10∶90）能获得满意的分离。

由正交试验结果可知，因素A对试验结果有显著影响，因素B、C对试验结果没有显著影响。因素A中A1、A2差异较大，A2、A3差异较小，故优选A2为最佳提取工艺。验证试验结果表明，优选工艺合理可行。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005：153.