仔猪肠道微生态环境的调控

2010-04-03张文俊贺建华

动物营养学报 2010年5期

张文俊贺建华

（湖南农业大学动物营养研究所,长沙 410028）

动物肠道中栖息着约500种细菌,数量达到1.0×1014,这些微生物与胃肠道食糜及胃肠组织构成一个复杂多样的菌群系统,该系统即肠道微生态环境,对宿主的生长和健康有重大意义[1]。近年来,关于仔猪胃肠道菌群系统的研究日益受到人们的重视,因为对仔猪胃肠道菌群结构及其某些特殊种属功能的研究将有助于寻求饲用抗生素的替代品[2]。此外,仔猪胃肠道菌群作为人类胃肠道菌群研究的模型,针对该模型的研究有助于了解胃肠道菌群对人类健康的影响。因此,本文就仔猪肠道微生态环境的生态学理论及肠道微生物区系的组成及变化、调控因素、研究方法及技术等研究进展进行了综述。

1 仔猪肠道微生态环境

仔猪刚出生时,胃肠道是无菌的,从分娩到体外环境的几个小时内,在胃肠道内迅速形成了一个庞大的微生物群落。仔猪出生后24 h,空肠、回肠、盲肠和直肠分别定植了双歧杆菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、消化球菌、肠球菌、小梭菌、拟杆菌、真细菌和酵母菌[3],出生3 d仔猪肠道内的微生物区系与母猪非常类似[4]。仔猪7日龄时发展出一个新的不同于母猪的微生物区系,同胎仔猪间的微生物区系仍类似,但与母猪已完全不同[4]。由于饲粮的改变,会降低微生物的发酵能力,再加上并栏,也会进一步改变猪体内微生物的组成。一般来说,猪肠道内微生物的代谢能力随日龄的增加而降低。到8～22日龄时,双歧杆菌、拟杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌和消化球菌成为优势菌。据报道,这些肠道菌群主要来源于母体。同时,细菌在消化道定植的顺序,首先是需氧菌,然后是兼性厌氧菌,最后是专性厌氧菌[5]。

过去,通过传统的微生物培养技术得知,健康成年猪的微生物区系相对成熟稳定,粪样和结肠中可培养细菌的具体组成和变化也比较清楚,而对仔猪微生物区系的组成和变化大多局限于乳酸杆菌和大肠杆菌[5]。赵桂英等[6]采用传统的微生物培养技术对断奶仔猪胃、十二指肠、盲肠、回肠、直肠内容物中的细菌进行培养,研究发现正常菌群有肠杆菌6.27×107,肠球菌4.70×107,葡萄球菌＜1.00× 104,双歧杆菌4.53×109,乳酸杆菌1.60×108,链球菌2.30×106,韦荣氏球菌1.49×105,小梭菌1.76×108,其中有益菌群是双歧杆菌、乳酸杆菌、类球菌、小梭菌,有害菌群是肠杆菌、韦荣氏球菌、葡萄球菌。由于传统的微生物培养技术的局限性,Yao等[7]对42日龄健康仔猪的粪细菌区系中的优势菌用PCR/DGGE技术,进行16S rDNA序列分析,发现区系中绝大多数优势菌属于未知或未培养的细菌,这些未知菌的最相似菌分属于肠球菌、链球菌、梭菌、消化链球菌和乳酸杆菌,而未检测到真杆菌、拟杆菌和普雷沃氏菌。姚文等[8]采用PCR/DGGE技术跟踪新生仔猪肠道和粪样细菌的演变,发现仔猪肠道微生物区系都是由出生时简单到断奶前复杂多样,断奶当天显著变少,断奶后较断奶前明显降低,而后微生物区系趋于多样且稳定。因此,断奶前后肠道微生物区系迅速变化期间是调控仔猪肠道菌群的最佳时期。

2 仔猪肠道微生态环境的调控因素

由于仔猪尤其是从出生到断奶前后的仔猪组织器官均发育不成熟,容易受到外界环境的影响,导致胃肠道菌群的失调。仔猪肠道微生物菌群失调主要是由于断奶应激、气候变化、饲料改变、病原微生物侵袭等原因引起[3]。仔猪的饲粮配方设计应主要围绕仔猪肠道微生态环境的调控来进行,主要的调控措施是使用各类添加剂。

2.1 抗生素

关于饲用抗生素对肠道微生物的影响,大量试验结果表明,饲用抗生素对动物肠道微生物呈现出抑制、促进或无影响等作用,报道结果变异很大,究其原因可能是由于不同的基础饲粮、不同的取样时间和部位以及不同的抗生素种类（抗菌谱不同）和添加水平造成的。虽然研究者提出饲用抗生素的促生长作用与肠道微生物的变化有关,但大多数试验结果不足以解释肠内微生物随畜禽生长的变化趋势,饲用抗生素在畜禽不同生长阶段是如何影响肠道菌群的,黏附在肠壁黏膜上的固有菌群是如何变化的,为何抗生素在畜禽幼龄阶段起到促生长作用而在生长后期效果不明显,这些均没有得到很好的解释[9]。姚浪群等[9]通过使用安普霉素研究其对仔猪肠道微生物及肠壁组织结构的影响,发现饲粮中添加安普霉素能明显降低仔猪腹泻发生率,对仔猪具有显著促生长作用。饲粮中添加90 mg/kg安普霉素对断奶后0～2、3～4周龄仔猪肠道（空肠、盲肠和结肠）中大肠杆菌的增殖均有明显抑制作用,且显著减轻小肠重量17.7%（P＜0.05）、缩短小肠长度13.7% （P＜0.05）,并使小肠绒毛排列规则、高度增加（P＜0.05）,绒毛高度与隐窝深度的比值增大。但由于抗生素在实际应用中带来的一系列问题,如残留、耐药性、二重感染和降低机体免疫力等,其应用受到了很大的限制,研制安全性高的抗生素和抗生素的替代品已成为研究热点[10]。

2.2 寡糖与多糖

寡糖是指2～10个单糖组成的一簇糖的总称,多糖是多个单糖聚合而成的糖。寡糖和多糖是一类不能被动物消化酶所分解而能进入到动物肠道后段的物质,这些物质能够被结肠的有益细菌选择性发酵利用,最终有利于肠道的微生态平衡。比如单纯的寡糖、植物提取物以及中草药制剂,其主要有效成分都是寡糖或多糖。大量研究表明,甘露寡糖在动物体内能够促进肠道有益菌的增殖,减少肠道病原菌,提高肠道黏膜的完整性,调节动物免疫反应从而提高动物的生产性能[11]。Mathew等[12]研究表明, 0.5%的半乳甘露寡糖对断奶仔猪大肠、回肠内容物中大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌均无影响。侯振平等[13]报道,饲喂不同浓度的半乳甘露寡糖降低了断奶仔猪回肠微生物种群数量,抑制了金色葡萄球菌、产气荚膜等有害菌,促进部分乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的繁殖;在结肠中,降低了大肠杆菌数,明显提高了结肠中乳酸杆菌和双歧杆菌数。张宏福等[14]报道,添加异麦芽低聚糖能有效抑制仔猪大肠杆菌的生长,同时能提高肠道中双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌的数量。陈清华等[15]通过研究牛膝多糖对肠道微生物的影响表明,试牛膝多糖对肠道中大肠杆菌生长有抑制作用,而对肠道中乳酸菌和双歧杆菌却有明显的增殖作用,且效果优于抗生素。K leessen等[16]发现菊粉可显著促进大肠中双歧杆菌、乳酸杆菌等生长,使梭菌、拟杆菌、大肠杆菌等数量减少。尹富贵等[17]研究发现刺五加提取物可通过提高断奶仔猪肠道乳酸菌增殖,增加乳酸的产量,降低肠道内容物的pH,从而抑制大肠杆菌繁殖,增加肠道内容物微生物的多样性,提高机体免疫力和生长性能。然而,王秀武等[18]通过海洋寡聚糖对仔猪结肠肠道微生态的影响研究发现,海洋寡聚糖对肠道微生物没有显著影响。综上所述,寡糖及多糖是当前一大研究热点,对仔猪肠道的调节通过对有益菌的增加和有害菌的抑制来提高机体免疫力从而改善生长性能。同时可知,并不是所有的寡糖对肠道微生物都有影响,不同种类糖的作用不同,有些糖促进有益菌的增殖,有些糖类没有反应;有些糖在回肠中起作用,有些糖在结肠中起作用。由此说明肠道微生物对其种类和作用部位有选择性,使得开发新原料也具有选择性。

2.3 益生素

益生素主要是指通过改善肠道微生态平衡而对畜禽发挥有利作用的活的微生物制剂。在饲料中使用微生物添加剂的目的,即是保持胃肠道内优势种群的稳定性和整个胃肠道微生态环境的相对稳定[19]。这方面报道比较多,技术也比较成熟。对于乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等几种菌种应用比较多,然而菌种的安全问题一直都是研究、生产和使用益生素关注的问题[3]。胡友军等[20]研究活性酵母对早期断奶仔猪肠道微生物区系的影响发现早期断奶仔猪饲粮中添加耐热性活性酵母能显著降低肠道内容物大肠埃希氏菌数和调节肠道微生物菌群平衡。张丽萍等[21]报道,猪源乳酸杆菌作为微生态制剂使用于15～45日龄的仔猪,在改善肠道微生态上效果明显好于EM菌,以浓度为0.15%的猪源乳酸杆菌试验组效果最好。

2.4 微量元素

多数研究者认为高铜有抗菌作用,可降低发病率。有研究表明高剂量铜能抑制肠道不良微生物菌群的生长,促进有益微生物菌群的生长,从而改变肠道微生物的结构。但由于高铜有环境污染的问题,因此高铜的安全饲喂量和抗菌作用的关系有待进一步研究[10]。有试验发现,饲粮中添加氧化锌也有助于维持断奶后仔猪肠道正常微生态,但这种作用仅限于断奶后前2周。高铜、氧化锌抑菌作用的机理有待进一步研究。贾建英等[22]研究表明对母猪头胎断奶仔猪饲喂酵母硒,酵母硒作为有机硒通过母乳来提高仔猪肠道中的乳酸杆菌,降低大肠杆菌。究竟是酵母的作用,还是硒的作用,还是二者的共同作用,尚有待于进一步的研究。陈群等[23]报道,添加FeSO4对患肠炎仔猪,随着铁添加量的增加,仔猪小肠内乳酸杆菌数略有减少,总菌中乳酸杆菌比例减小、大肠杆菌比例增大,大肠杆菌数相对乳酸杆菌数的比例也增大,大肠杆菌数和细菌总数都趋于增加,结果使结肠内细菌,肠道微生物菌群失衡。

2.5 酸化剂

由于胃肠道内乳酸杆菌等有益菌适宜在酸性环境中繁殖,而病原菌生长的适宜pH大多呈中性或偏碱性,因此酸化剂主要是通过降低胃肠道pH,从而抑制有害微生物繁殖,减少营养物质的消耗和抗生长毒素的产生,同时促进有益菌的增殖[24]。付建福[25]通过葡萄糖酸（GA）对断奶仔猪肠道微生物区系和肠黏膜形态结构的影响研究发现,猪的盲肠中的微生物可以发酵GA,GA可以调节盲肠微生物区系,增加短链脂肪酸产量和降低氨的浓度。李鹏等[26]通过对断奶仔猪添加复合酸化剂研究发现,添加酸化剂的各处理仔猪盲肠内大肠杆菌和沙门氏菌的数量显著低于没有添加酸化剂的对照组,其中添加乳酸型酸化剂B的效果更明显;添加酸化剂的处理的仔猪盲肠乳酸菌和双歧杆菌的数量显著高于对照组,其中添加乳酸型酸化剂B的效果更明显。乳酸型酸化剂B的抑菌效果要优于磷酸型酸化剂A,同类型酸化剂添加量越高抑菌效果越明显。这可能是因为乳酸本身比其他有机酸具有更强的抑菌杀菌作用。但也有报道,有机酸对35日龄仔猪各段消化道内大肠杆菌和乳酸杆菌无影响,这可能与35日龄仔猪胃肠道pH趋于相对稳定和试验饲粮组成有关。

2.6 酶制剂

由于在回肠末端吸收的营养物质对动物的意义远大于在大肠中吸收的物质,因此大多数人都忽略了营养物质对小肠中肠道微生物的影响。越是难于消化的饲粮越有利于肠道微生物的繁殖,添加了相应的酶制剂越能明显降低肠道微生物的数量。饲粮中添加酶所导致的肠道微生物的变化对动物营养的影响主要是间接的[27]。有研究表明,饲粮中添加木聚糖酶减少了肠道中利用淀粉和蛋白质的微生物数量,同时提高了利用木糖的微生物数量,说明外源酶分解所产生的糖对肠道原有的微生物发挥显著的选择压力[28]。

3 肠道微生物研究的方法

从传统上讲,主要利用基于培养的技术对胃肠道细菌进行研究,该技术在实验室广泛使用且需要了解个体营养需要。但是可培养微生物仍然占少数[29],通过传统的微生物培养技术,已知微生物区系相对成熟稳定的健康成年猪粪样和结肠中可培养细菌中约90%为厌氧革兰氏阳性细菌,主要分属链球菌属、乳酸杆菌属、梭杆菌属、真杆菌属和消化链球菌属;约10%为厌氧革兰氏阴性细菌,分属拟杆菌属和普雷沃氏属,而对仔猪微生物区系的组成和变化大多局限于乳酸杆菌和大肠杆菌。由于传统微生物技术的局限性,对猪肠道微生物区系缺乏较为真实的描述,特别是对仔猪出生后其肠道微生物区系的变化规律的研究非常薄弱[30]。近来,基于16S rRNA/rDNA基因的分子生物学技术的兴起对依靠培养的技术进行了补充,以用来开发多种生态系统包括哺乳动物胃肠道的细菌群落的多样性。这些技术能够鉴定和定量小型生物群,而且也可提供分类法来预测种系发育关系。克隆文库可以被测序,通常在种的水平上鉴定生物群的组成;指纹图谱技术可以分析微生物群落结构,而斑点杂交技术或荧光原位杂交技术能够测定特殊分类群的丰度。一些新兴技术,如功能基因及其表达以及稳定同位素和生物标记的联合使用,正在发展和优化,已用于研究个体或群体原位代谢活性。复杂微生物生态系统的核酸分离序列比较可以用于描述分子特性,同时也提供一个分类体系,可以预测自然进化关系[31]。基于16S rRNA的分子分析技术,包括变性梯度凝胶电泳（DGGE）、温度梯度凝胶电泳（TGGE）、单链构象多态性（SSCP）、限制性片段长度多态性（RFLP）等肠道微生物研究工作中常用的分子生物学技术方法。此外,从传统的培养到分子分析的过渡方法也逐渐得到应用。

4 小结

随着分子生物学技术的迅速应用,微生物区系的种类组成及其变化规律及作用机制逐渐被认识,微生物区的功能也会进一步揭示。从宏观到微观进一步深层次揭示肠道微生物的奥秘,更多的营养性的调控物有待开发和应用。

[1] 朱伟云,姚文,毛胜勇.肠道微生物研究:从组成到功能——肠道健康功能微生物的研究进展[C]∥冯定远.动物营养与饲料研究——第五届全国饲料营养学术研讨会论文集.北京:中国农业科学技术出版社,2006:191-194.

[2] 朱伟云,姚文,毛胜勇.仔猪胃肠道微生物区系发育规律及其调控[M]∥李德发.动物营养研究进展.北京:中国农业科学技术出版社,2004:225-228.

[3] 李德发.猪的营养[M].2版.北京:中国农业科学技术出版社,2003.

[4] 王晨辉,陈安国.改善早期断奶仔猪肠道环境和免疫状态的营养手段[J].上海畜牧兽医通讯,2000（5）: 20-23.

[5] TANNOCK GW,SVAGED C.In fluences o f dietary and environmental stress on m icrobial population in the murine gastrointestinal tract[J].Infection and Immunity,1974,9（3）:591-598.

[6] 赵桂英,杨亮宇,段纲,等.断奶仔猪胃肠道正常菌群的数量和分区[J].黑龙江畜牧兽医,2003（9）: 27-28.

[7] YAO W,ZHU W Y,HAN Z K,etal.Daidzein increased the density but not composition o f Lactobacills community in piglet digesta duringin vitrofermentation as revealed by DGGE and dilution PCR [J].Reproduction Nutrition Development,2004, 44（Suppl.1）:S17.

[8] 姚文,朱伟云,毛胜勇.16S rDNA技术研究新生腹泻仔猪粪样细菌区系的多样性变化[J].微生物学报,2006,46（1）:150-154.

[9] 姚浪群,萨仁娜,佟建明,等.安普霉素对仔猪肠道微生物及肠壁组织结构的影响[J].畜牧兽医学报, 2003,34（3）:250-257.

[10] 臧建军,车向荣,岳文斌.猪禽肠道微生物调控的研究[J].中国饲料,2002（16）:10-13.

[11] SPRING P,W ENK C,DAWSON K A,et al.The effects o f dietary mannanoligosaccharide on cecal parameters and the concentrations of enteric bacteria in the ceca of salmonella-challenged broiler chicks [J].Poultry Sc ience,2000,79（2）:205-211.

[12] MATHEW A G,ROBBINS C M,Chattin S E,et al.In f luence of galactosyl lactose on energy and protein digestibility,en teric m icroflora and perform ance o f weanling age[J].Journal of Animal Sc ience,1997,75（4）:1009-1016.

[13] 侯振平,张平,张军,等.半乳甘露寡糖对断奶仔猪肠道微生物多样性的影响[J].中国科学院研究生院学报,2008,25（3）:413-417.

[14] 张宏福,张莉,方路,等.异麦芽低聚糖对断奶仔猪肠道VFA浓度、pH及黏膜形态结构的影响[J].动物营养学报,2002,14（1）:22-23.

[15] 陈清华,贺建华,刘祝英.牛膝多糖对仔猪肠道微生物及小肠黏膜形态的影响[J].湖南农业大学学报:自然科学版,2007,33（6）:723-726.

[16] KLEESSEN B,SYKURA B,ZUNFT H J,et al. Effects o f inu lin and lactose on fecalm icroflora,m icrobial activity,and bowel habit in elderly constipated persons[J].Am erican Journal of Clinical Nutrition,1997,65:1397-1402.

[17] 尹富贵,印遇龙,孔祥峰,等.刺五加提取物对早期断奶仔猪肠道微生物多态性的影响[J].天然产物研究与开发,2007,19（4）:545-549.

[18] 王秀武,张丽,杜昱光,等.海洋寡聚糖对仔猪结肠内容物营养成分、肠道形态和肠道微生态的影响[J].中国动物保健,2005,25（1）:31-32.

[19] 谭权,张克英,丁学梅,等.木聚糖酶对肉鸡能量饲料的养分利用率和表观代谢能值的影响[J].动物营养学报,2008,20（3）:15-22.

[20] 胡友军,林映才,余德谦,等.活性酵母对早期断奶仔猪肠道微生物区系、肠黏膜形态和挥发性盐基氮的影响[J].养猪,2003（4）:3-5.

[21] 张丽萍,王永生.猪源乳酸秆菌对仔猪肠道微生物的影响[J].吉林畜牧兽医,2007,28（11）:10-12.

[22] 贾建英,王康宁,刘志理.饲喂酵母硒对母猪头胎断奶仔猪肠道微生物的影响[J].饲料广角,2007（7）: 23-26.

[23] 陈群,乐国伟,施用晖,等.铁对患肠炎仔猪生长性能、消化率及肠道微生物的影响[J].安徽农业科学, 2006,34（16）:3982-3998.

[24] 周勤飞,王永才.动物胃肠微生态及其调控[J].家畜生态,2004,25（4）:214-217.

[25] 付建福.葡萄糖酸对断奶仔猪生产性能、肠道微生物区系和肠黏膜形态结构的影响[J].饲料广角,2008 （15）:21-27.

[26] 李鹏,武书庚,张海军,等.复合酸化剂对断奶仔猪肠黏膜形态和肠道微生物区系及免疫功能的影响[J].中国畜牧杂志,2009,45（9）:28-31.

[27] 夏树,龙建.酶制剂对动物肠道微生态环境的影响[J].畜禽业,2004（11）:8-9.

[28] 杨海英,杨在宾,杨维仁,等.益生素和低聚木糖对断奶仔猪生产性能、消化酶活性、血液指标和肠道微生物的影响[J].中国兽医学报,2009,29（7）:914-919.