颜培宇,朱志中,王 芳,唐 强

(黑龙江中医药大学,黑龙江哈尔滨 150040)

人体免疫系统在抑制疾病的发生、发展中发挥重要作用。机体在疾病或应激状态下出现免疫活性细胞数目减少或亚群改变,细胞因子表达或分泌异常,免疫抑制性因子活性增强,从而导致机体防御及保护能力下降的免疫功能抑制。恶性肿瘤、不孕不育、脑血管病、艾滋病等都存在免疫抑制现象[1]。实验研究表明正气虚则细胞免疫功能低下、非特异性免疫功能降低,如体液免疫中 IgG和 IgM水平下降。因此,认为免疫抑制属中医虚证范畴。应用针灸学、现代免疫学理论和多学科方法或技术,研究针灸施于腧穴后对机体免疫系统的影响及其机理已成为近年来研究的热点。有关其作用机制的探索同样备受关注。本实验以免疫抑制大鼠为模型,探讨不同穴位针刺后对免疫抑制机体T细胞极化及相关细胞因子表达的影响,阐明针刺调整免疫功能的分子免疫学机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级健康 SD雄性大鼠 45只,体重200～250 g,由黑龙江中医药大学实验动物中心提供(许可证号scxk(京 )2007-0001)。

1.2 主要实验试剂

环磷酰胺(CTX)：由江苏恒瑞医药股份有限公司提供(批号 09041121);大鼠白介素 -4(IL-4)、大鼠干扰素 -r(IFN-r)ELISA试剂盒：由上海西唐生物科技有限公司提供;化学药品纯乌拉坦：国药集团化学试剂有限公司,批号 20080319;生理盐水：哈尔滨三联药业有限公司,批号 090504C2。

1.3 主要仪器

洗板机(Anthos 2010,type：24600,Austria.);离心机(LDZ4-2自动平衡离心机,江苏省金坛市医疗仪器厂);酶标仪(Anthos 2010,type：17550,Austria.)。

2 实验方法

2.1 实验分组

将大鼠随机分为 5组：正常对照组(A组),模型对照组(B组)、模型加头针组(C组),模型加体针组(D组),模型加头针体针组(E组)。正常对照组与模型对照组每天捆绑不针刺。

2.2 造模方法

取鼠后,饲养环境控制室温(22±1)℃,12 h光暗交替(7：00～19：00照明)。进入实验室最初 4天为适应环境期,自由进食和饮水,并每日抚摸 2～3 min,以适应实验人员操作。于实验第 5天除正常对照组外,各组均腹腔注射新鲜配制的环磷酰胺注射液,剂量 50 mg/kg体重 3天,第 4天加强注射 1次,制备免疫抑制模型[2]。正常对照组腹腔注射等量生理盐水。

2.3 穴位定位及针刺方法

2.3.1 选穴及定位 选穴：头穴(百会及四神聪)、体穴(足三里、关元)。取穴定位：参照“十一五”国家规划统编教材《实验针灸学》和《俞穴学》大鼠标准穴位图定位及拟人对照法定位。足三里穴区取穴膝关节后外侧,在腓骨小头下约 5 mm处取之;关元区位于大鼠两后肢、根部连线的中点;头穴区取穴 “百会”在大鼠头顶两耳根连线与前后中线交点(相当于人体百会穴),旁开 4 mm丛刺两针。

2.3.2 针刺方法 各组大鼠绑缚固定,针具选择华佗牌 30号 1寸针灸针[3],各穴进针 3～10 mm,留针 20 min。每隔 5 min进行补法捻针。每日 1次,治疗 7天。

2.4 标本采集

2.4.1 取血清 于实验第 8日按 0.5 ml/100 g给大鼠腹腔注射 25%乌拉坦,麻醉后用负压采血管心脏取血 4 ml左右;采血后将采血管放入 4℃冰箱静置 6 h,取出后 3000 r/min,离心 10 min;吸取上清液,移入小试管中,-40℃保存备用。

2.4.2 取全血 于实验第 8日按 0.5 ml/100 g给大鼠腹腔注射 25%乌拉坦,麻醉后用负压肝素抗凝血采血管心脏取血 1 ml左右,肝素抗凝血。

2.5 指标检测及方法

2.5.1 外周血 T淋巴细胞亚群检测方法 取肝素抗凝血 1 ml于小试管底部,分别加 20荧光标记的抗单克隆抗体,混匀,室温(18～25℃)孵育15 min。加红细溶解液 1 mL充分混匀。待红细胞完全溶解后上流式细胞仪检测。在波长 488 nm时,FITc(异硫氰酸荧光素)呈兰 -绿荧光,PE(藻红蛋白)呈橙红色荧光,计数 30000个细胞。记录分析直方图,据经 ELITE软件处理,以百分率报告。

2.5.2 血清 IFN-r及 IL-4含量检测 采用 ELISA法检测血清 IFN-r及 IL-4含量。

2.6 统计学处理

采用 SPSS13.0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,各组组间差异采用方差分析,以 P＜0.05作为具有显著性差异的标准。

3 结果

共纳入大鼠 40只进入结果分析(实验过程中麻醉意外死亡 2只、针刺过程中感染死亡 3只)。

3.1 实验各组 T细胞亚群检测结果

实验结果显示,头穴加体穴组(E组)可明显提高免疫抑制大鼠外周血 CD4+TC含量(12.82±4.15),显著高于 A、B、C、D组(P＜0.05);外周血 CD8+TC的含量治疗前后无明显变化(P＞0.05)。结果见表 1。

表1 各组大鼠外周血TC和TC的含量 (±s)

表1 各组大鼠外周血TC和TC的含量 (±s)

注：与 B组比较,**P＜0.01;与 A组比较,▲P＜0.01,▲▲P＞0.05;与 E组比较,*P＜0.05。

组别 n CD4+TC(%) CD8+TC(%)A组 8 12.07±3.99 6.48±0.14 B组 8 6.54±3.15▲ 6.37±0.11▲▲C组 8 11.85±5.59* 6.39±0.13▲▲D组 8 10.1±3.59* 6.41±0.12▲▲E组 8 12.82±4.15** 6.38±0.13▲▲

3.2 实验各组 IFN-r及 IL-4表达结果

实验结果显示,B组血清 IFN-r水平显著降低,与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。C、D、E组都可提高免疫抑制大鼠血清 IFN-r水平(P＜0.05或 P＜0.01),E组疗效优于其它各组(P＜0.05)。B组血清 IL-4水平显著升高,与正常组比较有显著性差异(P＜0.01)。C、D、E组都可降低免疫抑制大鼠血清IL-4水平(P＜0.05),E组疗效优于其它各组(P＜0.05)见表 2。

表2 各组大鼠外周血 IFN-r和 IL-4的含量 (±s)

表2 各组大鼠外周血 IFN-r和 IL-4的含量 (±s)

注：与 A组比较,*P＜0.01;与 B组比较,▲▲P＜0.01;▲P＜0.05。

组别 n IFN-r(pg/ml) IL-4(pg/ml)A组 8 29.37±16.65 6.92±1.88 B组 8 11.73+8.74C* 9.49+1.98*C组 8 19.28+3.82▲ 8.49+6.47▲D组 8 21.57+8.09▲ 7.08+5.67▲E组 8 25.03+7.63▲▲ 7.00+6.65▲

4 讨论

大量的临床与基础研究证实,针灸对机体的免疫系统具有双向调节作用。其中针灸调节 T淋巴细胞的功能是针灸治疗多种疾病的重要机制之一[4]。实验证实针灸不仅可以提高 T细胞及其亚群在外周血的比率,还能增强它的活性[4]。研究证实,针刺可提高束缚型大鼠血清 IL-2的含量[5]。辅助性 T淋巴细胞(helper T cell,Th)对机体的免疫功能具有重要的调节作用,CD4+T细胞按细胞因子的产生模式和生物学活性,有两种不同的亚群,分别为 Th1和 Th2,Th1细胞主要分泌 IL-2、IFN-r和 TNF-β,称为 Th1型细胞因子;Th2细胞主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6、IL-10,称为 Th2型细胞因子[6]。IFN-r能够促进 Th1细胞的分化,IL-4是 Th2分化的必需因子。Th细胞亚群是一个综合的免疫指标,便于评估机体免疫平衡状态和整体的免疫功能,具有很好的应用性。本实验选取IFN-r和 IL-4两个细胞因子指标,探讨针刺对免疫抑制机体的 T细胞亚群调整作用。实验结果证实,针刺可以显著提高 IFN-r水平,降低 IL-4水平,使机体的免疫应答向 Th1方向转化,具有增强免疫抑制机体细胞免疫应答的作用。头针加体针的疗效最佳,优于其它各治疗组(P＜0.05)。

环磷酰胺可导致机体出现不同程度的免疫抑制现象,是公认制备免疫抑制模型的方法[2]。中医认为“正气存内,邪不可干;邪之所凑,其气必虚”。中医所认为的虚证与现代医学所认为的免疫力低下、免疫抑制非常相似。故可以采用中医药治疗虚证的方法来治疗免疫抑制性疾病。针刺可以提高机体的免疫功能,常用的腧穴有“足三里”、“关元 ”等强壮穴。“足三里”和“关元”都可以通过神经 -内分泌 -免疫网络调整机体的免疫功能[7],具有增强机体免疫力、提高机体抗病能力的作用。百会头穴区在临床广泛用于脑血管疾病的康复治疗,取得满意的疗效。实验研究证实：头穴丛刺法具有提高脑缺血大鼠平衡、行走及抓握能力,增强患侧肌力的作用;能够增加缺血半影区微管相关蛋白 -2和突触素的表达;能够增加突触数目,保护神经元突触结构基本完整,增加突触活性区长度及突触后致密物质厚度。但头穴对免疫抑制机体的免疫功能影响尚未见报道。本实验以免疫抑制大鼠为模型,探讨了头穴加体穴配合方法对免疫抑制大鼠的 T细胞极化及相关细胞因子的影响,为针刺临床治疗免疫抑制性疾病提供了有力证据。

[1] 于颖梅,裴建,吴焕淦,等.针灸调节免疫抑制的研究进展[J].江西中医学院学报,2003,15(3)：37-40

[2] 高凡,钱嘉林,刘长喜,等.环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立[J].环境与职业医学,2004,21(4)：314-318

[3] 莫芳萍,吴滨,吴敬杰,等.针刺对大鼠闭合性重度颅脑损伤促醒作用的实验研究[J].针灸临床杂志,2008,24(9)：41

[4] 郑晖,梁繁荣,陈敏.近年来针灸调节免疫功能的国外研究进展[J].时珍国医国药,2009,20(3)：731-732

[5] 张露芬,李晓泓,郑宇,等.电针不同穴位对束缚模型大鼠血清白细胞介素 -2及不同组织 β-内啡肽含量的影响[J].中国临床康复,2005,9(20)：142-144

[6] 赵武述.辅助性 T细胞亚群的研究及其临床意义[J].中华医学检验杂志,1998,21(1)：7-8

[7] 陈雄华,刘又香.针灸“足三里”、“关元”穴对阳虚大鼠免疫功能影响比较研究[J].中国针灸,2000,20(9)：555-557