王青，薛曹叶，羊小海，王柯敏

（化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南大学化学化工学院，生物纳米与分子工程湖南省重点实验室，湖南长沙410082）

0 引言

锌离子是人体内含量仅次于铁的过渡金属，在许多生理，生化过程中发挥极为重要的作用。锌离子的浓度与多种疾病的发生紧密相关[1]。锌离子活性降低会引起神经元损伤，细胞凋亡也与锌离子有关。但如果锌的摄入过量，将会造成锌中毒。长期过量摄取含锌食物会影响铜代谢，造成低铜，锌、铜比值过高，可影响胆固醇代谢，形成高胆固醇血症，最终导致动脉粥样硬化、高血压、冠心病等。因此检测锌离子具有重要的意义。

目前锌离子的主要检测方法有原子吸收光谱法[2]，分光光度法[3]，离子色谱法[4]等，其中原子吸收光谱法灵敏度最高，但是这些方法仪器昂贵、操作繁琐，成本太高不利于普及。荧光法用于测定锌离子具有选择性好、灵敏度高、简便、快捷等优点，已经设计并合成出很多发光机理不同的荧光探针[5～6]。在溶液检测中，Yang等[7]构造了卟啉/β-环糊精超分子传感器，随着锌离子浓度增加，卟啉的荧光强度比例（I606/I656）逐渐增加，该方法对锌离子有良好的特异性。Hall等将锌离子受体氮杂环修饰到CdSe/ZnS核/壳量子点上，通过锌离子结合对量子点荧光强度的影响可以对锌离子进行定量检测，检测下限为2.4 μmol/L[8]。在细胞内外游离锌离子检测中，N-(6-me-thoxy-8-quinolyl)-p-toluene-sulfonamide（TSQ）广泛用于对细胞中的锌离子荧光成像。Gee等[9]合成了一种新的可见光激发的锌离子敏感型荧光探针FluoZin-3，成功用于胰腺β-细胞分泌锌离子的检测和成像。Tomat等[10]用Zinpyr标记的AGT融合蛋白对活细胞中的锌离子进行了检测。虽然已有的锌离子荧光探针有很多优势，但是它们都涉及到复杂的有机分子合成过程，成本较高，不利于普及。

S1核酸酶是能够特异性切割核酸单链的核酸酶，对锌离子有很强的依赖性，基于此特性发展了一种基于分子信标和S1核酸酶的锌离子检测新方法。该方法操作简便，不需要昂贵仪器，不涉及复杂的离子载体合成，对锌离子的检测下限为120 μmol/L。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

F-4500荧光分光光度计(Hitachi，日本)；恒温循环水浴(Amersham Biosciences公司，美国)；超纯水装置（Elix3，Millipore，U.S.A）。

分子信标序列：5'-TAMRA-CAT CTT GGA TTG CAT CAA AAA GAT TAA GAG ACC AAT CCA AGA TG-DABCYL-3'为色谱纯化，由大连宝生物（Takara）公司合成与纯化；S1核酸酶购买于大连宝生物（Takara）公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸、硫酸锌、氯化钠均为国产分析纯。所有溶液均用Milli-Q超纯水（18.2 MΩ·cm）配制，实验中所有配制样品溶液的水和缓冲溶液均经过高温灭菌处理。

1.2 可行性的考察

取95 μL缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，50 mmol/L NaCl），然后依次加入2 μL分子信标（终浓度为100 nmol/L）、2 μL不同浓度ZnSO4锌离子和1 μL S1核酸酶（终浓度为0.018 U/μL），并实时监测溶液荧光信号变化。激发波长为521 nm、发射波长为578 nm、激发狭缝为5 nm、发射狭缝为5 nm，所有检测均在60℃下进行。

1.3 Na+浓度的优化

取98 μL不同NaCl浓度的缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4），加入2 μL分子信标，使其终浓度为100 nmol/L，实时监测分子信标的背景荧光信号。

1.4 S1核酸酶浓度的优化

每个待测的S1核酸酶浓度下设置一个检测样品和一个对照样品。

检测样品：取95 μL缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL分子信标（终浓度为100 nmol/L）、2 μL ZnSO4（终浓度为1 mmol/L）和1 μL不同浓度的S1核酸酶，并实时监测溶液荧光信号变化。

对照样品：取97 μL缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL分子信标（终浓度为100 nmol/L）和1 μL不同浓度的S1核酸酶，并实时监测溶液荧光信号变化。

依照公式V0=（F1-F0）/t计算出检测样品和对照样品的反应初速度（V0）差，其中F0是加入S1核酸酶前分子信标的荧光强度，F1是加入S1核酸酶后反应时间为t的荧光强度，这里t取200 s。

1.5 分子信标浓度的优化

每个待测的分子信标浓度下设计一个检测样品和一个对照样品。

检测样品：取95 μL缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL不同浓度的分子信标、2 μL ZnSO4（终浓度为2 mmol/L）和1μLS1核酸酶（终浓度为0.018U/μL），并实时监测溶液荧光信号变化。

对照样品：取97 μL缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入2 μL不同浓度的分子信标和1 μL S1核酸酶（终浓度为0.018 U/μL），并实时监测溶液荧光信号变化。

计算出检测样品和对照样品的反应初速度之差。

1.6 锌离子的检测

取88 μL缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl，pH7.4，300 mmol/L NaCl），依次加入5 μL分子信标（终浓度为500 nmol/L）、5 μL不同浓度ZnSO4、2 μL S1核酸酶（终浓度为0.045 U/μL），并实时监测S1核酸酶切割分子信标的荧光信号。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

原理如图1所示。S1核酸酶特异性切割核酸单链，它的活性对锌离子有很强的依赖性，溶液中的分子信标维持茎环结构，荧光基团与熄灭基团靠近，荧光被熄灭，加入S1核酸酶可以切割分子信标的环部，导致荧光基团和熄灭基团远离，溶液中锌离子浓度越高，S1核酸酶切割分子信标速率越快，荧光增强速度越快，通过建立荧光增强的速率和锌离子浓度的标准曲线，就可以定量溶液中的锌离子浓度。

图1 基于分子信标和S1核酸酶检测锌离子原理图Fig.1 Schematic diagram of Detection of zinc Based on molecular beacon and S1 nuclease

2.2 可行性考察

在不同锌离子条件下用S1核酸酶对分子信标进行了切割，如图2所示，随着锌离子浓度增加，S1酶切割分子信标的速率加快，说明该方法可以用来检测锌离子浓度。但是分子信标的背景荧光较高，影响了检测效果，因此，后面需要对检测条件进行优化。

图2 不同锌离子条件下S1核酸酶切割分子信标荧光图(a)0 mmol/L锌离子;(b)0.4 mmol/L锌离子Fig.2 The real-time fluorescence scan curve of S1 nuclease cut molecular beacon with different zinc concentration(a)0 mmol/L zinc;(b)0.4 mmol/L zinc

2.3 Na+浓度的优化

分子信标需要在一定的离子强度条件下才能形成稳定的茎环结构，一般缓冲体系中会加入Mg2+。由于锌离子是一种二价阳离子，所以检测体系中没有引入Mg2+和其它二价阳离子，只用Na+调节缓冲体系的离子强度，因此对Na+浓度进行了优化，不同Na+浓度下分子信标的荧光扫描结果如图3所示，随着Na+浓度的增加，分子信标的背景荧光不断降低，但为了减少阳离子对检测的干扰，选择可以稳定分子信标构象的最低的离子强度，如图3所示，当Na+浓度达到300 mmol/L时，分子信标的背景荧光非常低，并且迅速达到平衡，说明300 mmol/L的NaCl可以很好地稳定分子信标的构象，因此选择300 mmol/L为检测时的Na+浓度。

图3 Na+浓度对分子信标背景荧光的影响图中曲线1～4的NaCl浓度分别依次为300、200、150、50 mmol/LFig.3 The fluorescence of molecular beacon with different Na+concentration From 1 to 4,the concentration of NaCl is 300,200,150,50 mmol/L

2.4 S1核酸酶浓度的优化

S1核酸酶浓度越大，切割分子信标速度越快，但是产生的背景越高，因此需要对S1核酸酶浓度优化其用量，如图4所示，图4A-D为不同S1核酸酶浓度下切割分子信标的实时荧光图，曲线1和2的锌离子浓度分别为1和0 mmol/L，图4E为计算出来的不同浓度S1核酸酶的反应初速度增加值，可以看出S1核酸酶浓度为0.045 U/μL时，加入ZnSO4反应初速率增加最大，因此选择0.045 U/μL的S1核酸酶为检测的S1核酸酶浓度。

图4 S1核酸酶浓度的选择（A-D）酶切实时荧光图，S1核酸酶浓度从A到D分别为0.018、0.045、0.09、0.18 U/μL，曲线1和2的Zn2+浓度分别为1和0 mmol/L；（E）酶切反应初速度增加值Fig.4 The selection of the concentration of S1 nuclease(A-D)The real-time fluorescence scan of hydrolize,from A to D,the concentration of S1 nuclease is 0.018,0.045,0.09,0.18 U/μL,respectively.Curve 1 and 2 indicate 1 and 0 mmol/L Zn2+;(E)The initial increased reaction velocity

2.5 分子信标浓度的优化

图5 分子信标浓度的选择（A-D）酶切实时荧光曲线，MB浓度从A到D依次为50、100、150、500 nmol/L，曲线1和2的Zn2+浓度分别为2和0 mmol/L；(E)酶切反应初速度增加值Fig.5 The selection of the concentration of molecular beacon（A-D）The real-time fluorescence scan of hydrolize,from A to D,the concentration of molecular beacon is 50,100,150,500 nmol/L,curve 1 and 2 indicate 2 and 0 mmol/L Zn2+;(E)The increased initial reaction velocity

分子信标浓度太低，检测信号就会不明显，浓度过高，背景荧光也会上升，且提高了检测成本，因此对分子信标浓度进行了优化。图5A-D为S1核酸酶切割不同浓度分子信标的实时荧光扫描图，曲线1和2的锌离子浓度分别为1和0 mmol/L，随着分子信标浓度增加，信号和背景荧光均增加，两者之差也增加，图5E为计算出来的S1核酸酶切割不同浓度分子信标的反应初速率增加值，可以看出随着分子信标浓度不断增加，S1核酸酶切割的反应初速率增加值不断增大，当分子信标浓度为500 nmol/L时，S1核酸酶切割的速率增加值达到0.803，此时绝对荧光值比较适中，并且考虑到检测成本，不再选择更高的分子信标浓度。因此选择500 nmol/L的分子信标为检测时的分子信标浓度。

2.6 锌离子的定量检测

用分子信标和S1核酸酶定量检测锌离子的结果如图6所示。其中，图6A为锌离子检测的实时荧光图，随着锌离子浓度增加，荧光增强的速度加快，不加锌离子时，S1核酸酶仍对分子信标有一定的酶切作用，这限制了锌离子的检测下限进一步降低。该背景可能是S1核酸酶的作用不是绝对依赖锌离子造成的。图6B为锌离子浓度和酶切反应初速度绘制的标准曲线，显示该方法对锌离子检测的检测下限为120 μmol/L。

图6 用分子信标和S1核酸酶检测锌离子(A)用分子信标和S1核酸酶检测不同浓度锌离子的荧光时间扫描曲线，从上到下，锌离子浓度依次为2.0、1.5、1.0、0.50、0.25、0.12、0 mmol/L；(B)检测不同浓度锌离子的反应初速度标准曲线Fig.6 Detection of zinc with molecular beacon and S1 nuclease(A)The real-time fluorescence scan of different concentration of zinc,from up to down,the concentration of zinc is 2.0,1.5,1.0,0.50,0.25,0.12,0 mmol/L;(B)The initial velocity of different concentration of zinc

3 结论

借助于S1核酸酶特异性切割单链DNA，其活性对锌离子浓度有依赖性，发展了一种基于分子信标和S1核酸酶的锌离子检测新方法，该方法操作简便，无需昂贵仪器，也不涉及复杂的离子载体合成，对锌离子的检测下限为120 μmol/L。

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