杨晓梅，鲍隆友，耿向永，蔡灵男

（1.西藏农牧学院动物科学技术学院，西藏林芝，860000；2.西藏农牧学院高原生态研究所）

西藏野生灵芝粗多糖提取工艺研究

杨晓梅1，鲍隆友1，耿向永2，蔡灵男1

（1.西藏农牧学院动物科学技术学院，西藏林芝，860000；2.西藏农牧学院高原生态研究所）

采用正交试验，对影响灵芝多糖提取的4个主要因素（料水比、提取温度、提取时间、醇析浓度）进行了最佳工艺条件研究。结果表明，提取灵芝子实体粗多糖采用水提醇沉法，最优工艺条件为：料水比1∶50，提取温度90℃，提取2次，每次提取2 h，90%乙醇醇析，3 000 r/min离心30 min取沉淀，sevage法除游离蛋白，离心取上层液即为灵芝粗多糖溶液。苯酚-硫酸法测定灵芝子实体粗多糖含量约为0.734%，这一含量在全国灵芝子实体多糖含量中处于中等水平，还有待于进一步的研究和开发利用。

西藏；野生；灵芝；粗多糖；提取

灵芝是我国中医药宝库中的灿烂瑰宝，几千年来备受中华民族的珍爱和崇拜。其中灵芝多糖又以其特有的医学功效成为灵芝的主要活性成分，其含量已成为衡量灵芝质量的重要指标之一[1]。多糖由多种醛糖和酮糖通过糖苷缩合而成，是一种天然多聚体，其分子量从几百到数十万，除一小部分小分子多糖外，大多不溶于高度醇而溶于热水。根据多糖的这种化学特性，灵芝多糖的一般提取过程是：技术处理→分离纯化→含量测定。本试验以西藏野生灵芝（Ganoderma lucidum）为材料，探究在西藏高海拔条件下灵芝粗多糖的提取工艺，以期为西藏野生灵芝的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1．1 试验材料

新鲜灵芝采自西藏林芝地区林芝县、米林县。试验试剂有葡萄糖（成都化学试剂厂生产）、浓硫酸（四川省德阳市化学试剂厂生产）、苯酚（成都化学试剂厂生产）。仪器设备有752-紫外分光光度计、万分之一分析天平、全自动高压灭菌锅、水浴锅。

1.2 试验方法

①灵芝子实体多糖的提取 将灵芝子实体表面冲洗干净后放入烘箱中，50℃烘干至恒质量，然后在粉碎机中以1 400 r/min粉碎3遍，并过直径为102 mm的网筛得絮状物，密封于磨口玻璃瓶中干燥保存备用。

灵芝子实体多糖的提取主要采取水溶提取法。根据前人研究结果[2～4]选择料水比、提取温度、提取时间、醇析浓度4个对提取灵芝多糖影响较大的提取因素分别按单因素试验和正交试验方法来确定灵芝粗多糖提取的最优工艺方法。

试验采用的提取工艺流程是：称量→加料液→热水浸提→过滤→热水浸提→过滤→（合并2次滤液）醇析（除去单糖、双糖、低聚糖等成分[5]）→离心（3 000 r/min，离心30 min）取沉淀→sevage法除游离蛋白（取上一步沉淀与sevage液混合并用力振荡5 min）→离心（3 000 r/min，离心30 min）取上层液，上层液即是灵芝粗多糖溶液，可用于测定。

②多糖含量测定 测定灵芝多糖含量采用苯酚-硫酸法。灵芝粗多糖含量根据葡萄糖标准曲线回归计算。

a.配制标准葡萄糖溶液。取一定量的葡萄糖放入烘箱中，105℃干燥至恒质量，冷却后，精确称取10 mg，定容至100 mL，即为0.1 mg/mL的标准液，4℃冰箱中保存备用。

b.测定最大吸收波长。精确量取标准葡萄糖溶液0.5 mL于10 mL具塞试管中，蒸馏水为空白，加水至1 mL，后加入5%苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，迅速振荡混匀，室温下放置30 min。取一定量的液体在不同波长下测定吸光度。波长设定范围在370～590 nm。

c.绘制标准葡萄糖曲线。精确量取标准葡萄糖溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL于10 mL具塞试管中，蒸馏水为空白，加水至1 mL，后加入5%苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，迅速振荡混匀，室温下放置30 min。取一定量的液体在最大吸收波长下测定吸光度。

d.测定标准溶液精密度。取0.5 mL葡萄糖标准溶液和0.5 mL蒸馏水置于10 mL具塞试管中混匀，加5%苯酚1.0 mL和浓硫酸5.0 mL，迅速振荡混匀，室温下放置30 min。取一定量的液体在最大吸收波长下测定吸光度。重复测定5次，求RSD值。

1.3 灵芝子实体多糖提取的单因素影响

①料水比对灵芝子实体多糖提取的影响 准确称取灵芝粉末1.0 g放入蒸馏瓶中，按设计的料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50加入蒸馏水。标号后放入温度80℃的水浴锅中加热回流1.5 h，过滤收集滤液，重新提取一次，合并2次滤液并将滤液浓缩，将滤液和浓度80%的乙醇溶液混合，4℃静止过夜，3 000 r/min离心20 min，取沉淀按sevage法除蛋白，离心取上清液定容得灵芝粗多糖溶液，苯酚-硫酸法测定吸光度。

表1 正交试验因素和水平表L9（34）

表2 葡萄糖标准溶液精密度及相对标准偏差

②提取温度对灵芝子实体多糖提取的影响 准确称取灵芝粉末1.0 g放入蒸馏瓶中，按设计的60℃，70℃，80℃，90℃，100℃下提取。提取料液比为1∶30，加热回流1.5 h，过滤收集滤液，重新提取一次，合并2次滤液并将滤液浓缩，将滤液和浓度80%的乙醇溶液混合，4℃静止过夜，3 000 r/min离心20 min，取沉淀按sevage法除蛋白，离心取上清液定容得灵芝粗多糖溶液，苯酚-硫酸法测定吸光度。

③提取时间对灵芝子实体多糖提取的影响 准确称取灵芝粉末 1.0 g放入蒸馏瓶中，按设计的0.5 h，1 h，1.5 h，2 h，3 h分别提取。提取温度80℃，加热回流，过滤收集滤液，重新提取一次，合并2次滤液并将滤液浓缩，将滤液和浓度80%的乙醇溶液混合，4℃静止过夜，3 000 r/min离心20 min，取沉淀按sevage法除蛋白，离心取上清液定容得灵芝粗多糖溶液，苯酚-硫酸法测定吸光度。

④醇析浓度对灵芝子实体多糖提取的影响 准确称取灵芝粉末1.0 g放入蒸馏瓶中，料水比1∶30，放入温度80℃的水浴锅中加热回流1.5 h，过滤收集滤液，重新提取1次，合并2次滤液并将滤液浓缩，将滤液和按设计的醇析浓度70%，75%，80%，85%，90%乙醇溶液混合，4℃静止过夜，3 000 r/min离心20 min，取沉淀按sevage法除蛋白，离心取上清液定容得灵芝粗多糖溶液，苯酚-硫酸法测定吸光度。

⑤正交试验 根据灵芝子实体多糖提取的单因素试验结果，以料水比、提取温度、提取时间和醇析浓度为因素，设计了4因素3水平的L9（34）正交试验。其试验因素水平设计见表1，处理见表3。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

从图1中可以看出，葡萄糖标准溶液吸光度的变化趋势是先上升后下降，其中在490 nm处有最大特征吸光度，说明采用苯酚-硫酸法测定葡萄糖含量最适的测定波长为490 nm。

2.2 标准葡萄糖曲线的绘制

从图2中可以看出，葡萄糖含量在0～0.08 mg间符合比尔定律，与吸光度有良好的线性关系，回归方程是y=9.763 3x+0.044 1（R2为0.942 9，n=8）。

2.3 标准溶液精密度

从表2可以看出，所配标准溶液精密度的RSD为2.70%（n=5），说明试验的重复性很好。

2.4 单因素对灵芝子实体多糖提取的影响

①料水比对灵芝子实体多糖提取的影响 从图3中可以看出，在其他提取条件不变的情况下，随着料水比的增加，提取的灵芝粗多糖量也随之增加，说明灵芝粗多糖能够溶于水中，但在水中的溶解度并不是很大，需要不断增加溶剂的量来达到溶质的溶解。从图3来看，这个平衡势在料水比小的情况下很容易达到，所以说从柱形图的增长趋势来看，在料水比为1∶50时，从细胞内部提取出来的多糖量仍有继续增加的趋势，即意味着可以通过增加更多的水溶剂（即降低料水比）得到更多的多糖，但同时也要注意太小的料水比也会增加后序浓缩的负担。为了优化灵芝子实体多糖提取工艺中料水比，可以选用1∶30，1∶40和1∶50作为下一步试验的因素水平。

图1 波长与吸光度的关系

图2 葡萄糖标准曲线

图3 料水比对子实体多糖提取的影响

图4 提取温度对子实体多糖提取的影响

②提取温度对灵芝子实体多糖提取的影响 从温度对灵芝子实体多糖提取影响的柱形图中可以看出（图4），在其他提取影响因素相同的条件下，在60～100℃范围内，灵芝子实体多糖的提取量随着提取温度的增加而增加。试验设计中如果温度继续升高，会使高温条件下多糖的糖链断裂，导致多糖提取量下降并影响到多糖的生物活性，另一方面，西藏地处世界的 “第三极”，平均海拔在4 000 m以上，空气压强随海拔升高而降低，所以在西藏作为溶剂的水在90℃左右即可达到沸腾，试验中所采用的100℃温度是在立式高压菌锅中实现的。考虑到试验只是对西藏野生灵芝多糖的提取工艺进行研究，所以试验中不需要耗用更多的能源。由此确定以后的试验中采用的温度是70℃、80℃和90℃。

③提取时间对灵芝子实体多糖提取的影响 提取时间也是影响多糖提取的直接因素之一，从图5中可以看出，当提取时间在0.5～1.5 h变化时，多糖含量的变化非常大，提取时间增多，多糖得率快速增加，而提取时间在1.5～3 h变化时多糖含量有缓慢降低的趋势，但这种降低从直线斜率来看并不是很明显。说明开始时干燥子实体需要一段时间吸水软化，故提取的多糖含量较小；软化后，因为胞内溶液与提取液中粗多糖浓度差相差很大，扩散进行很快，单位时间内多糖提取量较多；但随着胞内多糖浓度降低，扩散速度减慢，多糖提取量也就减少，而且提取时间越长，细胞内积温越高，也会引起多糖结构的破坏，不利于灵芝多糖的提取。同时考虑到为缩短工时，减少能耗和节约资金，暂以提取时间1 h，1.5 h，2 h作为下一步正交试验的时间选择。

图5 提取时间对子实体多糖提取的影响

图6 醇析浓度对子实体多糖提取的影响

表3 L9（34）正交试验结果

表4 L9（34）正交试验的方差分析

④醇析浓度对灵芝子实体多糖提取的影响 由于多糖是极性大分子化合物，可溶于水而不溶于醇，不同浓度的乙醇可沉淀出不同组分的多糖，多糖的分子量越大，被沉淀下来所需要的乙醇浓度越小，乙醇浓度越大沉淀下来的多糖分子量越小，多糖含量越高。从图6中可以看出，随着酒精浓度增加灵芝多糖的提取量也在增加，特别是酒精浓度70%～80%时，在提取的灵芝多糖含量上有了很大的转折，而在80%～90%之间灵芝多糖的含量变化并不是很大，多糖含量变化的趋势线基本趋于直线，一方面说明浓度在80%以上的酒精对灵芝多糖的提取影响开始减弱，另一方面也说明80%～90%的醇析浓度基本上可以沉淀各种分子量的灵芝多糖。

⑤正交试验结果 试验数据采用DPSv6.55数据处理软件中的正交试验分析功能处理，分析结果如表3和表4。

据表3正交试验结果，极差R愈大的因素对指标的影响愈显著[6]，从极差值可以看出决定试验结果因素的主次关系为D＞B＞C＞A，从各水平的总提取率K来看，最优组合为D3B3C3A3即试验条件：料水比为1∶50，提取温度为90℃，提取时间为2 h，醇析浓度为90%。

以表3试验数据进行方差分析，结果见表4，由表中p值可见，影响灵芝多糖提取率的显著因素是醇析浓度和提取温度，与直观分析的结果一致。但是最优组合并未出现在正交表中，综合考虑以上的分析结果，灵芝多糖的最优提取工艺条件为：料水比1∶50，提取温度90℃，提取2次，每次提取时间2 h，90%乙醇醇析，3 000 r/min离心30 min取沉淀，sevage法除游离蛋白，离心取上层液即为灵芝粗多糖溶液。

3 小结与讨论

通过试验发现，西藏野生灵芝粗多糖的最优提取工艺条件为：料水比1∶50，提取温度90℃，提取2次，每次提取2 h，90%乙醇醇析，3 000 r/min离心30 min取沉淀，sevage法除游离蛋白，离心取上层液即为灵芝粗多糖溶液。通过苯酚-硫酸法测定西藏野生灵芝子实体粗多糖的含量约为0.734%。对比夏志兰等[7]的研究发现，西藏野生灵芝子实体多糖含量处于中等水平，对于灵芝子实体多糖的提取有待进一步的研究。而这一含量在全国灵芝品种中也处于中等水平，可以将野生灵芝加以人工驯化，改善野生灵芝的品质以提高人工栽培灵芝的品质，这样的研究工作还有待于进一步的加强。

[1]陈合，胡云红，秦俊哲，等.灵芝菌原生质体融合条件研究[J].食品科学，2007，28（2）：173-176.

[2]张志军，李淑芳，刘建华.灵芝多糖提取-水浸提条件的研究[J].天津农学院学报，2005，12（1）：12-15.

[3]陈瑜，梁运祥，胡咏梅，等.固体发酵灵芝菌丝多糖的提取及组分分析[J].中国食用菌，2007，26（3）：34-37.

[4]王慧杰，李宇伟，连瑞丽，等.灵芝多糖液体发酵条件优化[J].食用菌学报，2007，14（1）：37-42.

[5]宁慧青.不同食用菌多糖含量的比较研究[J].山西化工，2007，27（3）：44-46.

[6]洪伟，吴承祯.试验设计与分析原理·操作·案例[M].北京：中国林业出版社，2004：99-101.

[7]夏志兰，周连玉，刘明月.灵芝深层发酵优良菌株的筛选[J].菌物研究，2007，5（2）：75-80.

Study on Crude Polysaccharide Extraction Technology of Tibet Wild Ganoderma lucidum

YANG Xiaomei1,BAO Longyou1,GENG Xiangyong2,CAI Lingnan1
(1.School of Animal Science and Technology,Tibet Academy of Agriculture and Husbandry Animal Sciences,Linzhi, Tibet 860000;2.Reasearch Institute of Tibet Plateau Ecology)

The ganoderan is the main active ingredient of theGanoderma lucidum,which content has become an important indicator to measure its quality.Using water extraction and alcohol precipitation method extracts crude polysaccharide of the mythic fungus germ-entity,the optimal conditions analyzed orthogonal experiment method is followed below:ratio of material to water is 1∶50,the extraction temperature is 90℃,and extracting for twice per 2 h,90%alcohol analysis,centrifuging for 30 m at 3 000 rpm and take precipitation,using the way of sevage to remove floating preteins,centrifugation and taking the upper liquid which is theG.lucidumcrude polysaccharide liquid.It is using the way of Phenol-sulfuric acid method to measure the contents of the crude polysaccharide of the mythic fungus germ-entity which is 0.734%,and it is at upper middle level at polysaccharide of the mythic fungus germ-entity nationwide,it is also demanding further research and development and use.

Tibet;Wild;Ganoderma lucidum;Crude polysaccharide;Extraction

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.22.013

西藏自治区科技计划项目“西藏野生灵芝人工繁育技术研究”（2008AG15-02）

杨晓梅（1972-），女，讲师，主要从事生物化学教学与科研工作，E-mail：xiaomeiy1972@163.com

鲍隆友（1953-），男，通信作者，教授，主要从事植物学的教学与科研工作，电话：13989940995

2010-07-22