扈新民，李亚利，2，赵丹，高彦辉，罗爱玉，唐瑞勇，李红民

（1.甘肃省航天育种工程技术研究中心，天水，741030；2.甘肃省天水市蔬菜产业开发办公室）

辣椒SRAP分子标记的优化及在航椒4号种子纯度检测中的应用

扈新民1，李亚利1，2，赵丹1，高彦辉1，罗爱玉1，唐瑞勇1，李红民1

（1.甘肃省航天育种工程技术研究中心，天水，741030；2.甘肃省天水市蔬菜产业开发办公室）

为了对SRAP分子标记在辣椒中的应用进行优化，试验采用正交设计L16（45），在4个水平上对影响辣椒SRAP反应体系的Taq酶浓度、Mg2+含量、模板DNA用量、dNTP浓度及引物用量等5个因素进行了优化，并用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平，建立了辣椒SRAP分子标记的最佳体系。结果表明，在10 μL反应体系中，Taq酶最适浓度为1.5 U、Mg2+最适浓度为1.5 mmol/L、模板DNA最适用量为100 ng、dNTP最适用量为0.3 mmol/L、引物最适浓度为0.1 μmol/L。利用20个辣椒材料来验证此反应体系，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果显示，扩增产物在350～750 bp之间多态性高，且反应体系的稳定性和重复性好。通过优化的SRAP分子标记对F1代辣椒种子航椒4号进行纯度检测，检测结果为98%，与其田间检测结果100%十分接近。表明了SRAP分子标记技术是鉴定辣椒一代杂种纯度的有效方法，具有准确、可靠、快速的特点，在辣椒杂交种子纯度室内快速检测中有很大的应用前景。

辣椒；SRAP；体系优化；正交分析法；完全随机试验；纯度检测

近十几年来，分子标记技术发展异常迅速，已相继开发出了多种分子标记技术，如RFLP、RAPD、SCAR、AFLP、ISSR、SRAP等[1]SRAP标记（Sequence-Related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性）是由Li等[2]开发出的一种分子标记技术，该标记具有多态性高、信息量丰富、技术简便、结果稳定和成本较低等特点，适用于基因定位、基因克隆、生物多样性分析[3]、遗传图谱构建[4]、杂种优势预测以及比较基因组学[5]等多个研究领域。目前SRAP标记已经应用于水稻、苹果、柑橘、樱桃、大蒜、莴苣、棉花、西瓜、油菜、莲藕、甘薯等作物的研究中[6～10]。SRAP标记是基于PCR技术的一种标记技术，同其他标记一样，SRAP反应条件受多种因素的影响，如PCR反应中模板DNA浓度、Taq酶、引物浓度、Mg2+浓度以及dNTP的浓度等，且不同物种对反应条件的要求也存在一定的差异。因此有必要对辣椒SRAP反应体系中各个组分的浓度、用量以及组合效应进行筛选。本研究利用正交设计分析法[11]结合单因素完全随机试验，对PCR反应中几个影响试验结果的主要因素进行优化，以期找到最佳反应体系。

F1代杂交种子纯度直接影响到农业生产，因此种子纯度的检测是种子质量的关键。在中华人民共和国国家标准 《农作物种子检验规程》（GBJT3543-1995）中，种子真实性和纯度是必检项目。传统上F1代杂种的纯度主要是通过田间检测来完成，也有一些是采用形态学鉴定法和同工酶分析法，但就种子而言，田间检测和形态学鉴定均存在一定的缺点。例如田间鉴定需要的时间较长，而幼苗鉴定受外界环境条件影响较大，如水分、光照、温湿度等，观察时，由于数量性状较多，质量性状的差异比较难找，在一定程度上也影响了鉴定的可靠性和准确性。籽粒形态法鉴定时，因杂交种往往同其母本种子形态相似，而反交种又不易和正交种的父本种子区别，且亲本同源组合种形态亦相似；另外，在种子成熟过程中，气候、水肥等外界因素影响均可能改变种子的大小、颜色，所以形态学鉴定法难以真正鉴别大多数品种，只适合少数品种。同工酶分析法存在的主要问题是有限酶类的分析会带来一定的偏差，因为所选酶的所有基因未必都表达在酶谱上，同时酶变异也未必都和形态变异有关，这就不易区别有些品种的杂交种及亲本。另外，种子的发育阶段或外界因素也会对酶谱分析带来一些影响。而基于DNA基础的分子标记不受环境限制和影响、无表型效应，具有客观、稳定、快速、高效等特点，因此分子标记技术在种子纯度检测中得到了迅速的应用[12～14]。本试验就是为了优化SRAP分子标记反应体系，为今后其在辣椒杂交种航椒4号进行纯度检测中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的辣椒材料均取自甘肃省航天育种技术研究工程中心研发基地。2009年10月温汤浸种后，播于温室营养钵，常规管理。用于SRAP-PCR反应的Taq酶、dNTP、Mg2+均购于西安鼎国生物公司，引物购于北京三博远志公司，标准分子量（Marker）DL2000购于西安鼎国生物公司。

1.2 试验方法

①辣椒DNA的提取与浓度的测定 试验材料辣椒杂交种航椒4号及其父母本各育苗200株，待幼苗长出2～3片真叶时，剪取真叶，采用改良CTAB法[15]提取DNA。用Eppendorf公司生产的BioPhotometer核酸检测仪检测DNA溶液浓度与纯度，并将其稀释为100 ng/μL，-20℃下保存待用。

②PCR反应因素水平的初步确定与正交表的设计 为了确定PCR反应中5个因素 （Taq DNA聚合酶，Mg2+，模板DNA，dNTP，引物）的最佳水平，初步采用正交设计L16（45），在4个水平上进行试验，共16个组合，L16（45）设计方案见表1。试验设3次重复，再分别进行5个水平的单因素完全随机试验，逐个优化其他反应成分的终浓度，以确定相对较优的因素组合。

③SRAP-PCR扩增 引物设计参照Li等[2,5]、Ferriol等[3]发表的引物序列的报道，选用上游19个引物和下游20个引物。PCR扩增程序参照Li等[2]的方法：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，35℃复性1 min，72℃延伸1 min，共5个循环；然后，再94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸1 min，共35个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

④PCR产物的检测 采用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶，160 V电压电泳，待二甲苯氰移动至胶板2/3处时停止，银染显色。最后在凝胶迷你成像系统中照相并记录分析。

⑤SRAP最佳反应体系的验证 利用20个辣椒品种对优化确定的辣椒SRAP-PCR反应体系及反应参数的稳定性进行验证。

⑥航椒4号辣椒杂交F1代纯度的检测 利用所优化的辣椒SRAP-PCR体系对辣椒品种航椒4号杂种一代进行纯度检测。

表1 PCR反应正交试验L16（45）设计

2 结果与分析

2.1 利用正交设计和完全随机试验优化辣椒SRAP反应体系

①正交设计分析确定辣椒SRAP反应体系的关键影响因素 按表1设计的16个处理进行PCR反应后，将得到的产物进行电泳，结果如图1。从图1中可以直观看出，在16个处理组合中由于Taq DNA聚合酶，Mg2+，模板DNA，dNTP，引物5个因素浓度组合的不同，扩增的效果存在明显差异。处理1，6，11模板DNA浓度过低，扩增产物模糊、带微弱，不易观察。处理4，9，15的dNTP浓度高与游离Mg2+结合对PCR有抑制作用，背景色深，带形弥散并有拖带现象。处理3，12，16的Mg2+和dNTP浓度均高，背景色深，不易观察。综合考虑各因素，处理10扩增的条带清晰，航椒4号的父本和母本都得到很好的扩增结果，为最佳组合。即在10 μL的反应体系中，Taq DNA聚合酶，Mg2+，模板DNA，dNTP，引物的浓度分别为1.5 U，1.5 mmol/L，100 ng，0.3 mmol/L，0.1 μmol/L。

②Mg2+浓度对辣椒SRAP标记的影响 利用单因素完全随机试验，以引物Em18OD3研究辣椒PCR反应体系中Mg2+浓度（0.5～2.5 mmol/L）对扩增结果的影响。当一种PCR组分进行试验时，其他组分浓度不变。扩增结果如图2所示，在Taq酶为1.0 U反应体系中，Mg2+浓度为0.5，1.0 mmol/L时扩增条带弱；浓度为1.5～2.0 mmol/L时条带比较清晰，但浓度为1.5 mmol/L时最清晰，扩增效果最好；当浓度达到2.5 mmol/L时扩增的特异性降低，条带弥散。确定 Mg2+的最终浓度为1.5 mmol/L。

图1 辣椒SRAP-PCR正交试验结果

图2 辣椒Mg2+浓度对辣椒SRAP标记的影响

图3 辣椒模板DNA用量对辣椒SRAP标记的影响

图4 dNTP浓度对辣椒SRAP标记的影响

图5 Taq酶浓度对辣椒SRAP标记的影响

图6 引物浓度对辣椒SRAP标记的影响

③DNA浓度对辣椒SRAP标记的影响 利用单因素完全随机试验，以EM18OD3为引物，研究辣椒PCR反应体系中模板DNA（50～250 ng）浓度对扩增结果的影响。结果如图3所示，在Taq酶为1.5 U反应体系中，DNA在100～200 ng均能产生清晰的条带，所以DNA终浓度选为100 ng。

④dNTP浓度对辣椒SRAP标记的影响 扩增结果如图4所示，dNTP浓度为0.1 mmol/L时，扩增出来的条带较浅，当dNTP浓度大于0.3 mmol/L时，由于dNTP能与游离Mg2+结合，降低了Mg2+浓度，从而影响PCR扩增产物，使扩增条带亮度变弱。所以dNTP浓度在0.2～0.3 mmol/L扩增效果最佳。

⑤Taq酶浓度对辣椒SRAP标记的影响 扩增结果如图5所示，当 Taq酶浓度为0.5 U和1.0 U时，扩增出来的条带较弱且条带较少，当浓度超过2.0 U时扩增出来的条带较模糊不够清晰，Taq酶浓度为1.5 U时出现明亮清晰的条带，所以Taq酶最适浓度为1.5 U。

⑥引物浓度对辣椒SRAP标记的影响 扩增结果如图6所示，当引物浓度在0.1～0.3 μmol/L时，扩增的效果较好；当引物浓度在0.4～0.5 μmol/L时，出现非特异性扩增，所以最佳引物浓度在0.1～0.3 μmol/L。

2.2 最佳反应体系稳定性检测结果

应用上述最佳反应体系，运用两对不同引物对10份辣椒DNA进行SRAP扩增，结果如图7所示。引物对每份DNA样品均扩增出清晰的条带，说明该体系稳定，为辣椒SRAP分子标记最佳反应体系。

2.3 F1杂交种纯度的检测

从本次纯度检测SRAP分子标记电泳结果中，我们得到3种结果，也就是说引物通过扩增出现3类情况：第一类，对其亲本F1代扩增没有差异条带；第二类，偏母本型，F1代与母本有共有带，与父本没有；第三类，偏父本型，F1代与父本有共有带，与母本没有。在这3类结果中，第一类不能用于F1代杂种纯度鉴定，只有把偏父本型与偏母本型结合使用才能准确鉴别F1代杂交种的纯度[17，18]。对33株辣椒品种航椒4号进行SRAP分子标记纯度检测，发现32株有父母本的特异条带，其纯度为98%（图8，9）。与田间对其航椒4号辣椒的纯度进行农艺性状调查验证结果为100%非常接近，证明了SRAP分子标记技术是鉴定辣椒一代杂种纯度的有效方法，具有准确、可靠、快速的特点，在辣椒杂交种子纯度室内快速检测中有很大的应用前景。

图7 最佳反应体系对10份辣椒品种的聚丙烯酰胺扩增结果

图8 F1杂交种纯度的检测（偏母本型）

图9 F1杂交种纯度的检测（偏父本型）

3 结论与讨论

本研究利用正交试验设计和单因素完全随机试验对辣椒SRAP-PCR反应体系进行了优化。在PCR反应体系中各个因素间互相都产生作用，Taq酶受Mg2+浓度的影响，而Mg2+的最终反应浓度主要受到dNTP的影响，当dNTP浓度过高时游离Mg2+被吸附从而使Mg2+浓度降低。本试验利用正交试验设计进行PCR反应体系优化的方法可以综合考虑观察各个因素间的互相作用，再结合较少因素的完全随机试验可逐步筛选其他成分的最佳浓度水平。通过筛选得到最佳反应体系为：10 μL体系中，模板DNA 100 ng、Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 0.3 mmol/L，引物0.1 μmol/L，Taq酶1.5 U。

利用SRAP分子标记进行种子纯度的鉴定已经在花生[19]、西瓜[20，21]等作物中应用，但在辣椒种子纯度鉴定中的应用尚未见报道。本试验利用SRAP分子标记检测杂交种子航椒4号辣椒种子纯度为98%，与其田间农艺性状的检测结果100%非常接近，所以通过本次试验充分说明利用SRAP分子标记可以在DNA水平上检测辣椒种子纯度，还可运用于辣椒分子标记辅助育种，从而提高育种的效率，加快育种进程，促进辣椒育种工作的发展。

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Optimization of SRAP Marker in Pepper and Its Application in Purity Testing of Hangjiao No.4 Seeds

HU Xinmin1,LI Yali1,2,ZHAO Dan1,GAO Yanhui1,LUO Aiyu1,TANG Ruiyong1,LI Hongmin1
(1.Space Breeding Engineering Research Center of Gansu Province,Tianshui 741030; 2.Vegetable Industry Development Office of Tianshui)

The experiment was conducted to investigate the impact of Taq enzyme concentration,Mg2+content,amount of template DNA,concentration of dNTP and amount of primer on SRAP reaction system for pepper by using ofL16(45)orthogonal design.The fully random single factor experiment design was used to select the optimum level for each factor to optimize the SRAP amplification system.The results showed that in the 10 μL reaction system,the optimum concentration of Taq enzyme,Mg2+,template DNA,dNTP and primers are 1.5 U,1.5 mmol/L,100 ng,0.3 mmol/L and 0.1 μmol/L,respectively.The established amplification system was tested on 20 pepper strains and 6%denaturing polyacrylamide gel electrophoresis results showed that the amplified products were in the range of 350-750 bp polymorphism,and the reaction system was proved in good stability and reproducibility.Using the optimized SRAP markers to test seeds of Hangjiao No.4,the results was 98%,and the purities were very close to the purities field tested 100%,which indicated that SRAP markers would have a wide range of application in rapid lab test of seed purities of watermelon hybrid cultivars.

Pepper;SRAP markers;Optimization system;Orthogonal design analysis; Completely ran-domized design; Purity Testing

10.3865/j.issn.1001-3547.2010.22.003

“十一五”国家科技支撑计划（2008BAD97B06-2），甘肃省科技孵化器项目（094TTPA0016）

扈新民（1982-），男，硕士研究生，研究方向为蔬菜育种与生物技术，E-mail：hxm821219@126.com

李亚利，通信作者，硕士研究生，研究方向为蔬菜育种与生物技术，E-mail：chairsh@126.com

2010-06-30