刘 辉,吴卫平,朱效华,冶保献

1)郑州师范学院化学系郑州 450044 2)商丘师范学院化学系商丘 476000 3)郑州大学化学系郑州 450001

#通讯作者,男,1958年7月生,博士,教授,研究方向:生物电化学及电分析化学

槐定碱(sophoridine,SR)属苦参碱类生物碱,广泛分布于苦参和苦豆子等中草药中,属四环喹诺里西啶类(quinuolizindine),其分子骨架可看作2个喹诺环的稠和体。槐定碱具有抗肿瘤、抗心律失常、抑制免疫功能和抑菌消炎等作用,临床上用于癌症、心律失常和肝炎等疾病的治疗[1],对恶性滋养细胞肿瘤亦有显著疗效,同时对恶性淋巴瘤和消化道肿瘤也有一定疗效,且毒性较低[2]。近年来,有关 SR的研究方法主要集中在测定[3-6]方面。而利用电化学手段系统研究SR的电极反应机制未见报道。作者研究了SR在玻碳电极上的电化学行为及其电极反应机制,有助于了解其在体内的氧化还原代谢机制,以进一步阐明其在体内的代谢状况和过程;同时,建立了差示脉冲伏安法测定 SR含量的新方法,为生物医药研究提供一定的理论基础和依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 仪器:CHI-620A电化学系统(上海辰华仪器公司);三电极体系,玻碳电极为工作电极(GCE,d=3mm),饱和甘汞电极(SCE)为参比电极(文中所指电位均为相对于SCE的电位),铂丝为对电极;TU-1901紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。试剂:SR(中国药品生物制品检定所),硼酸-氯化钾-碳酸钠(A-P)缓冲溶液,其他试剂均为分析纯或优级纯,实验用水为二次蒸馏水。

1.2 SR循环伏安行为及电极动力学参数测定 所有实验均无需除氧且在室温下进行。将玻碳电极先在金相砂纸上抛光,再依次用 1.00、0.30和 0.05 μm的Al2O3浆在麂皮上抛光至镜面,每次抛光后用蒸馏水冲洗,然后在超声波中用新鲜的二次蒸馏水清洗。取10m L A-P缓冲溶液(pH 7.4)于电解池中,加入100μL的SR标准溶液,于0～1.2 V电位范围内进行循环伏安扫描,记录其峰电流-峰电位曲线及相关数据,进行 SR的电极行为研究及电极动力学参数(α、n、ks、Do和反应质子数)的求算。

1.3 干扰实验 在1.2实验方法下,分别观察实际样品中ZnSO4、CaCl2、MgSO4、KH2PO4、NaAc、K2HPO4、柠檬酸、抗坏血酸和维生素 B1等干扰物对分析方法的影响。

1.4 SR峰电流-浓度曲线绘制 选用测定灵敏度高、分辨率好的差示脉冲伏安法来确定分析条件。在50 mV脉冲高度,脉冲宽度为0.05 s的最优条件下,分别记录加入 8×10-7、1×10-6、2×10-6、5× 10-6、1×10-5、1.5×10-5、2×10-5、3×10-5和3.5× 10-5mol/L的SR标准溶液差示脉冲伏安曲线,绘制SR峰电流-浓度曲线。

1.5 混合尿样中SR含量的测定 用10m L的A-P缓冲溶液(pH 7.4)稀释20μL的尿样混合液,不经过任何前处理转移到电解池。在 1.4实验方法下,进行差示脉冲伏安扫描,记录差示脉冲曲线,进行混合尿样中SR含量的测定。

2 结果

2.1 峰电流与SR浓度关系 结果见图1。可知,峰电流随SR浓度增加而增加,并在 8.0×10-6～3.0× 10-4mol/L浓度范围内呈线性关系,检出限为2.0× 10-6mol/L,其线性回归方程和确定系数分别为:

对5.0×10-5mol/L的SR重复测定10次,相对标准偏差为3.0%。

图1 SR峰电流-浓度曲线图

2.2.1 SR的循环伏安行为 SR在0～1.2 V电位窗口的循环伏安扫描曲线见图 2。图中曲线 a为空白底液的扫描曲线;曲线b为在空白底液中加入SR (5.0×10-4mol/L)后的循环伏安曲线,在0.875 V处出现 1个氧化峰。反扫时无还原峰。

图2 SR的循环伏安图a:A-P(pH 7.4)缓冲溶液;b:A-P(pH 7.4)缓冲溶液+SR (5.0×10-4 mol/L),扫描速度100m V/s。

2.2.2 α、n及ks的确定 根据Nicholson[7]公式,对于不可逆阳极反应,峰电位(Ep)与lnv间的关系可表述为:

其中,Eθ为标准电动势,α为电荷转移系数,nα为SR氧化过程中电子转移数,Do为SR扩散系数, F为法拉第常数(96 485 C/mol),ks为表观电子传递速率常数。在 20～400 mV/s扫描范围内,以 Ep对lnυ作图得一直线(图3),根据直线斜率,可求出αnα=0.87,假设α=0.5,则nα=n=1.75≈2,于是α即为 0.44。同时根据恒电位电解法,由法拉第定律也计算出其 nα为 2,证明上述假设成立。

另外,从Ep-lnv直线纵坐标上外推到v=0时,可求得Eθ,根据直线的截距可以计算出 ks的值为7.12×10-3s-1。

图3 Ep-lnv曲线图

2.2.3 Do的测定 根据峰电流与扫速呈一次线性关系,初步说明 SR在玻碳电极上反应过程为扩散控制过程,由Controll方程[8]:

其中Q为电量。绘制Q-t1/2关系曲线(图4),从曲线斜率求得SR的Do为2.16×10-5cm2/s。

图4 Q-t1/2曲线图

2.2.4 参与电极反应的质子数 可由溶液pH值改变对Ep的影响来求得。根据能斯特方程:

绘制Ep-pH关系曲线(图5)。由直线斜率求得m值,从而求得参加电极反应的质子数。从 Ep-pH直线的斜率求得m=2,从而得知参与电极反应的质子是 2,说明有 2个[H+]参与了电极反应。

图5 Ep-pH曲线图

2.3 干扰实验 结果表明,100倍ZnSO4、CaCl2、Mg-SO4和KH2PO4,50倍的NaAc、K2HPO4和柠檬酸,10倍的抗坏血酸对实验不干扰;只有高浓度维生素 B1(1.5×10-4mol/L)存在的情况下,干扰测定。

2.4 混合尿样中SR的测定 结果见表1。

表1 混合尿样中SR测定结果

3 讨论

作者通过对电解前后的试液进行紫外光谱对比,发现电解前后紫外光谱图变化不大,初步推断出电解前后没有新的共轭双键生成,因此判断氧化反应不可能发生在与羰基碳相连的位置。结合实验得出的SR电极动力学参数,其电极反应机制可认为是喹诺环N2与O发生了配位反应,反应方程见图6。

由于电化学反应机制不可避免地涉及氧化还原过程,而在研究生命科学及药物的药理机制过程中往往涉及电荷的转移。怎样有效地通过多种电化学手段,从而获取有关电化学反应机制、药理作用机制和生命化学机制等多种信息引起了分析化学工作者的极大关注[9]。

图6 SR在玻碳电极上的反应机制图

通过对SR在玻碳电极上的电化学行为的研究,作者推导出了其在电极上的氧化反应机制,有助于了解SR在体内的氧化还原代谢机制,从而进一步阐明其在体内的代谢状况和过程。同时,该研究还建立了差示脉冲伏安法测定SR含量的新方法,为生物医药研究提供一定的理论基础和依据。

[1]洪阁,刘培勋.槐属植物生物碱化学成分及药理作用研究进展[J].中草药,2005,36(5):783

[2]李雪梅,吴云光,潘达鑫,等.新型抗肿瘤药槐定碱[J].中国新药杂志,2006,15(8):654

[3]饶毅,魏惠珍,王明义,等.毛细管电泳法同时测定复方苦参注射液中三种生物碱含量[J].分析科学学报, 2003,19(3):225

[4]Wu YJ,Chen JJ,Cheng YY.A sensitive and specific HPLCMS method for the determination of sophoridine,sophocarpine and matrine in rabbit plasma[J].Anal Bioanal Chem,2005,382(7):1 595

[5]Wu YJ,Chen JJ,Cheng YY.Determination of sophocarpine, matrine and sophoridine in Kuhuang injection by GC-MS [J].JAnalytChem,2005,60(10):967

[6]姚慧琴,高作宁,韩晓霞,等.苦参碱类生物碱在玻碳电极上的直接电化学行为及电分析方法研究[J].中国中药杂志,2005,30(10):765

[7]马伟,孙登明.聚L-精氨酸修饰电极存在下同时测定多巴胺和肾上腺素[J].分析化学,2007,35(1):66

[8]Bard AJ,Faulkner LR.Electrochemical methods fundamentals and app lications[M].New York:Wiley,1980:535

[9]董社英,韩晓峰,黄廷林.克拉霉素的电化学反应机理研究与应用[J].化学学报,2007,65(11):1 039