吴大鹏,卢 红,张洪志

河南大学淮河医院肿瘤科开封 475000

△男,1976年1月生,硕士,主治医师,研究方向:肿瘤放射治疗,E-mail:wudapeng321@163.com

舌鳞状细胞癌在口腔癌中最常见[1],目前采用传统手术治疗并辅以放疗和化疗等综合治疗手段,舌癌治愈率仍只有10%～45%。因此,深入认识肿瘤放射敏感性调控机制,通过人工干预增强放射敏感性,对提高肿瘤放疗效果具有重要的意义。为了解 β-榄香烯乳联合照射是否能提高人舌鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的治疗效果及其对肿瘤细胞凋亡和裸鼠外周血白细胞的影响,作者进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂 人舌鳞状细胞癌细胞株(Tca-8113细胞,上海交通大学口腔医学院惠赠);BALB/c雄性裸鼠,7周龄,体质量18～22 g(购自中山大学实验动物中心);β-榄香烯乳规格为0.1 g/20 mL (购自大连华立金港制药集团有限责任公司);RPMI 1640(购自Gibco公司);DNA-Prep(流式细胞仪试剂,购自Beck Man Coulter公司);主要实验仪器有双光子直线加速器、流式细胞仪和血常规检测仪等。

1.2 Tca-8113细胞的培养和裸鼠移植瘤模型的建立 常规培养并收集Tca-8113细胞,用RPMI 1640培养液制成密度为 1×107m L-1的肿瘤细胞悬液备用。在无菌条件下从每只裸鼠右侧大腿处向皮下注射2×106个肿瘤细胞(0.2 mL/只),建立Tca-8113细胞裸鼠皮下移植瘤模型。

1.3 实验分组与处理 肿瘤移植后第 8天,从 60只移植瘤裸鼠中选择40只瘤体大小约0.1 cm3的裸鼠,随机分成5组,每组8只。空白组:0.2 mL生理盐水腹腔内注射,每天1次,连续注射5 d;单纯药物组:β-榄香烯乳按50mg/kg用生理盐水稀释至0.2 mL腹腔内注射,每天1次,连续注射5 d;单纯照射组:裸鼠固定于特制的铅盒中屏蔽射线以保护正常组织,将患肢固定并暴露于照射野中,电子线照射移植瘤,每次2 Gy,每天1次,连续照射5 d;药物(1 h)﹢照射组:用β-榄香烯乳作用1 h后照射,余操作过程同单纯药物组和单纯照射组;药物(2 h)﹢照射组:用β-榄香烯乳作用2 h后照射,余操作过程同单纯药物组和单纯照射组。

1.4 裸鼠肿瘤生长时间的测定 细胞接种后连续观察移植瘤形成和生长情况,用游标卡尺测量肿瘤最长径a和最短径b(mm),每3 d测1次,根据公式:移植瘤体积 =ab2/2进行计算。各组裸鼠移植瘤体积达到约0.1 cm3后进行实验处理,连续测量并观察移植瘤体积变化,当体积达到 1.2 cm3后终止裸鼠饲养。肿瘤生长时间为各组移植瘤体积从0.1 cm3生长至1.2 cm3的时间。

1.5 裸鼠外周血白细胞数检测 当各组裸鼠移植瘤体积达到1.2 cm3后,从眼球后静脉丛抽取血液使用血常规检测仪检测白细胞总数。

1.6 移植瘤细胞凋亡率的测定 采用流式细胞仪法。各组裸鼠抽血后,分别采用脱颈法处死并剥离肿瘤,切成0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm大小组织块,置于体积分数为 70%冷乙醇中固定,4℃过夜。用匀浆法及等梯度稀释法制成细胞密度为 105mL-1细胞悬液,收集细胞于离心管内,1 000 r/min离心5 min后,弃上清液。PBS洗涤、离心后用体积分数为70%冷乙醇固定,4℃过夜。上机测试前,再用PBS洗3次。加入碘化丙啶(PI)染液,4℃染色30 min。取样本 200μL,上流式细胞仪进行细胞凋亡分析。

1.7 统计学处理 采用SPSS 10.0对各组裸鼠肿瘤生长时间、外周血白细胞数及细胞凋亡率进行析因设计的方差分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 裸鼠移植瘤的成瘤和生长情况 60只裸鼠接种肿瘤成瘤率为85%(51/60)。各组裸鼠肿瘤生长时间见表 1、表 2。

表1 各对照组和药物(1 h)+照射组裸鼠肿瘤生长时间比较(n=8) d

表2 各对照组和药物(2 h)+照射组裸鼠肿瘤生长时间比较(n=8) d

2.2 裸鼠外周血白细胞数检测结果 见表3、表4。

2.3 裸鼠移植瘤细胞凋亡率检测结果 见表5、表6。

表3 各对照组和药物(1 h)+照射组裸鼠外周血白细胞数比较(n=8)×109 L-1

表4 各对照组和药物(2 h)+照射组裸鼠外周血白细胞数比较(n=8)×109 L-1

表5 各对照组和药物(1 h)+照射组裸鼠移植瘤细胞凋亡率比较(n=8) %

表6 各对照组和药物(2 h)+照射组裸鼠移植瘤细胞凋亡率比较(n=8) %

3 讨论

β-榄香烯乳是从中药莪术中提取出来的具有抗癌活性的国家二类抗癌新药,已广泛应用于临床,其抗癌机制与抑制DNA和RNA合成及诱导肿瘤细胞凋亡有关,在低细胞毒性浓度下即可对离体培养的Tca-8113细胞有放射增敏作用[2]。该研究中在照射与药物 2个因素组合下经析因设计的方差分析后发现:照射与药物(1和2 h)分别对肿瘤生长时间有影响,可以延长裸鼠肿瘤生长时间;药物(1 h)+照射组照射间无交互作用,尚不能认为是否给予药物对有无照射的裸鼠生长时间有影响,而药物(2 h)+照射组照射间有交互作用,说明药物与受照射之间有交互协同作用,联合作用较单独照射或单独药物作用更能延长裸鼠肿瘤生长时间。提示对 β-榄香烯乳作用 1 h后再放疗不能达到提高放射敏感性的目的,而作用2 h联合放疗的疗效要大于单纯药物或单纯放射治疗的疗效,且 2者联合起到协同增敏效果。

研究[3-4]显示凋亡反应的提高提示细胞有更大的放射敏感性。现在学术界已提出将诱导凋亡水平作为肿瘤放射敏感性的一种衡量指标[5-6]。该研究中流式细胞仪检测各组细胞凋亡率:药物(1 h)+照射组照射间无交互作用,尚不能认为是否给予药物对有无照射的裸鼠肿瘤细胞凋亡率有影响;而药物(2 h)+照射组,药物组主效应差异有统计学意义,照射组主效应差异有统计学意义,说明药物作用2 h与照射分别对肿瘤细胞凋亡率有影响,不同程度提高肿瘤细胞凋亡率。药物作用 2 h和照射间有交互作用,即联合作用较单纯药物或单纯照射更能有效提高肿瘤细胞凋亡率,这一用联合作用方法提高肿瘤凋亡率的趋势与联合作用延长肿瘤生长时间的趋势相一致。提示:β-榄香烯乳作用 2 h后联合照射所致肿瘤细胞凋亡率的提高可能是联合协同增敏的原因之一,联合措施处理肿瘤后可能重建了某种肿瘤抑制基因介导的细胞凋亡途径,从而达到提高放射治疗疗效和放射增敏的目的。

因为 β-榄香烯不含蒽环、苯环、环氧及硝基等毒性基团,所以无骨髓抑制作用,对肝肾功能无损害,是一种有效且较安全的抗肿瘤药物。该研究结果显示药物(1 h)+照射组和药物(2 h)+照射组:药物组主效应差异无统计学意义,用药 +照射无交互作用,尚不能说明是否给予药物对有无照射的裸鼠白细胞数有影响。该研究证实:单纯 β-榄香烯乳作用于裸鼠后外周血白细胞数变化不大,未出现骨髓抑制,是一种有效且较安全的抗肿瘤药物;药物联合照射组外周血白细胞总数降低系照射所致,与 β-榄香烯乳作用无关。

总之,该研究结果证实:β-榄香烯乳联合照射能提高人舌鳞状细胞癌裸鼠移植瘤的放射治疗效果,照射前2 h应用β-榄香烯乳能起到放射增敏的作用;联合作用能有效诱导细胞凋亡,且 β-榄香烯乳对白细胞没有明显抑制作用。

[1]邱蔚六,张震康,王大章.口腔颌面外科理论与实践[M].北京:人民卫生出版社,2000:642

[2]程伟,乔哲,石涛,等.β-榄香烯对肾癌细胞的体外放射增敏作用[J].西安交通大学学报:医学版,2004,25(2):182

[3]Sakakura C,Sweeney EA,Shirahama T,et al.Overexp ression of bax enhances radiation sensitivity in human breast cancer cells[J].Surg Today,1997,27(1):90

[4]Lang FF,Yung WK,Raju U,etal.Enhancement radiosensitivity ofwild-type p53human glioma cells by adenovirus-mediated delivery of the p53 gene[J].JNeurosurg,1998,89(1): 125

[5]Kurdoglu B,Cheong N,Guan J,et al.Apoptosis as a predictor of Paclitaxel-induced radiosensitization in human tumor cell lines[J].Clin Cancer Res,1999,5(9):2 580

[6]殷蔚伯,余子豪,徐国镇,等.肿瘤放射治疗学[M].北京:北京医科大学·中国协和医科大学联合出版社, 2008:294