赵 燕,姚志华,马 杰,刘艳艳,杨树军#,刘 涛

1)河南省肿瘤医院内科郑州 450008 2)河南省肿瘤医院病理科郑州 450008 #通讯作者,男,1965年1月生,本科,主任医师,研究方向:恶性肿瘤

由于缺乏典型的临床症状及灵敏的检测手段,绝大部分胰腺癌患者就诊时已属晚期,失去手术机会,5 a生存率仅为 1%～5%[1]。异常的信号传导通路是多数肿瘤发生发展的主要机制之一。P21ras蛋白为重要的信号转导物,转化生长因子-α(transforming growth factor-alpha,TGF-α)及表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)为生长信号的发放者。作者利用免疫组织化学法检测 3种蛋白在胰腺癌组织中的表达情况,探讨其与胰腺癌发生发展的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集河南省肿瘤医院 2001年3月至2007年 7月普通外科手术切除并经病理确诊的原发性胰腺导管腺癌标本 30例,患者男 20例,女 10例,年龄 30～76岁;胰头部癌 25例,其他部位癌 5例;按国际抗癌联盟(UICC)胰腺癌(1987)病理分级标准,高、中分化癌21例,低分化癌9例;按UICC胰腺癌 TNM分期系统,Ⅰ～Ⅱ期 16例,Ⅲ～Ⅳ期14例;有淋巴结转移 13例,无淋巴结转移 17例。患者术前均未接受化疗和放疗。以该院手术切除的胰腺良性病变标本中的正常胰腺组织 10例作对照。1.2 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白检测 采用免疫组化SP法检测。鼠抗人P21ras单克隆抗体、鼠抗人TGF-α单克隆抗体及兔抗人EGFR多克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司,抗体稀释度1:50;超敏SP(广谱)试剂盒及DAB试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司。标本石蜡包埋,4μm厚切片,二甲苯脱蜡,乙醇梯度水化,体积分数 3%H2O2甲醇溶液消除内源性过氧化物酶,高压水煮修复抗原,滴加一抗4℃过夜,PBS漂洗,依次滴加生物素标记的二抗及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶,DAB显色,苏木素复染。用已知的阳性切片作阳性对照,以PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定标准[2-3]高倍镜(×400)下选取 5个视野进行观察,每个视野观察细胞不少于 200个。P21ras蛋白:以胞质出现棕黄色颗粒且着色细胞数≥5%为阳性表达。TGF-α:以胞质和(或)胞核出现棕黄色颗粒且着色细胞数≥10%为阳性表达。EGFR:以胞质出现棕黄色颗粒和(或)胞膜出现棕黄色染色且着色细胞数≥20%为阳性表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 15.0进行统计处理,胰腺癌与正常组织 3种蛋白表达的差异及不同临床病理特征胰腺癌组织中 3种蛋白表达的差异采用确切概率法分析,对胰腺癌组织中TGF-α与EGFR蛋白表达的关系进行关联性分析,计算列联系数,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白检测结果 见图1、表1。胰腺癌组织中P21ras的表达不均匀且异质性明显,呈局灶性或弥漫性分布;正常胰腺组织中仅个别表达,且呈局灶性分布。胰腺癌组织中TGF-α及EGFR均呈弥漫性表达,正常胰腺组织中TGF-α及EGFR仅个别病例呈局灶性表达或不表达。3种蛋白在胰腺癌组织中的表达水平均高于正常胰腺组织。

图1 正常胰腺及胰腺癌组织中P21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表达(SP,×400)A 1,A 2:胰腺癌及正常胰腺组织中P21ras蛋白的表达;B 1,B2:胰腺癌及正常胰腺组织中TGF-α蛋白的表达;C 1,C2:胰腺癌及正常胰腺组织中EGFR蛋白的表达。

表1 胰腺正常及癌组织中P 21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表达例(%)

2.2 P21ras、TGF-α及EGFR蛋白表达与胰腺癌临床病理特征的关系 见表2。由表2可知,P21ras蛋白的表达与胰腺癌的病理分级、临床分期及淋巴结转移有关,TGF-α、EGFR与胰腺癌的病理分级、临床分期及淋巴结转移无关。

2.3 胰腺癌组织中TGF-α及EGFR表达的关联性分析 见表3。

表2 P 21ras、TGF-α及EGFR表达与胰腺癌临床病理特征的关系 阳性例数(%)

表3 胰腺癌中TGF-α与EGFR表达的关联性分析 例

3 讨论

细胞发生癌变主要由于两方面的异常:一方面为胞外和(或)胞内控制细胞生长增殖的信号增多,如生长因子及生长因子受体过表达;另一方面为细胞增殖信号从细胞表面向核内传导过程中,某个或某些环节如信号转导物、蛋白激酶及转录激活物发生改变,使细胞生长失去正常生理信号的调控,从而产生肿瘤的各种生物学和病理学特征。

研究[4]显示,90%的胰腺癌患者存在k-ras基因突变,k-ras基因通过在 12、13或 61位密码子的突变而大量活化,造成其编码蛋白 P21ras大量表达,同时也使P21ras蛋白的空间构型和功能发生改变,使P21ras蛋白处于持续活化状态,不断向下游发放生长信号,从而改变了正常细胞的生长与调控,使细胞进入增殖周期,阻止细胞发生分化。反义k-ras基因可下调k-rasmRNA和P21蛋白表达,从而抑制胰腺癌细胞的增生并促进凋亡,说明P21ras蛋白大量表达参与了胰腺癌的发生与发展[5]。作者的研究结果显示,胰腺癌组织中P21ras蛋白的表达高于正常胰腺组织,且在高、中分化、Ⅰ ～Ⅱ期及无淋巴结转移癌组织中的表达高于低分化、Ⅲ～Ⅳ期及有淋巴结转移的癌组织,与李淑德等[6]结果一致,提示P21ras蛋白的表达是胰腺癌一早期而普遍的事件,检测P21ras蛋白有助于胰腺癌的早期诊断。

TGF-α是一类在肿瘤的发生发展中起关键作用的生长因子,它能够与EGF竞争,与EGFR结合,激活EGFR胞内区的酪氨酸激酶,继而催化其下游的靶蛋白的磷酸化,从而将细胞外信号传递到细胞内,最终促进靶细胞的 DNA合成及有丝分裂。利用化学致癌剂诱导的大鼠胰腺导管腺癌[7]及人胰腺导管腺癌[8]组织中均可发现TGF-α及EGFR的过表达。作者的研究结果显示,TGF-α与EGFR在胰腺癌组织中高表达,但 2者的表达与胰腺癌的病理分级、临床分期及淋巴结转移无关;胰腺癌组织中 2者的表达密切关联。Pina等[9]将EGFR抑制剂应用于胰腺癌细胞系,发现癌细胞增殖抑制与凋亡的程度与TGF-α密切相关。许雅等[10]利用反义TGF-α及反义EGFR转染胰腺癌PC-7细胞系构建稳定的双重转化细胞系,结果双重转化细胞系细胞更容易发生凋亡。上述研究结果均提示,TGF-α及EGFR参与了胰腺癌的形成,TGF-α/EGFR形成的自分泌环是胰腺癌形成的重要机制。

靶向性药物是目前抗癌药物研究的热点,胰腺癌分子靶向药物的研究主要集中于单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂以及肿瘤疫苗等[11],尤其是针对EGFR的cetuximab及酪氨酸激酶抑制剂erlotinib[12-14]。作者的研究结果显示P21ras、TGF-α及EGFR有可能成为胰腺癌药物治疗的靶点,为靶向药物的应用提供了理论基础。

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