王燕燕， 张耀举， 庄友谊

(温州大学物理与电子信息工程学院， 浙江 温州 325035)

0 前 言

图1 荧光在光学成像系统中的传播路径

早在1852年，Stokes就观察到了荧光现象.1904年人们提出把荧光技术与显微镜结合起来建立荧光显微镜的设想，1908年试制成功了第一台荧光显微镜.之后，荧光显微术得到了迅速的发展，并在各个领域得到了广泛的应用.目前应用的荧光显微术主要有：共焦荧光显微术、全内反射荧光显微术、多光子荧光显微术以及近场荧光显微术.共焦荧显微术利用“针孔”效应, 可对样品进行纵深剖析[1].全内反射荧光显微术则可有效排除本体干扰,获取界面层信息[2].多光子激发荧光显微术根据非线性光学原理提高了空间分辨率[3].近场荧光显微术则借用扫描隧道显微镜原理,得以突破传统光学衍射的限制[4].最近几年，国际上新发展了一种基于荧光受激辐射损耗的显微术(称为STED), 这种技术可以在远场成像的条件下实现纳米级大小的分辨率[5].

2007年，Wai Teng Tang等人对金属薄膜的plasmon效应在局域性荧光显微中的作用进行了理论推导，并且和实验数据进行了比较[6].2009年，Francois Aguet等人提出了用信号与系统的滤波技术对荧光成像图案的荧光单分子进行定位[7].本文的目的是用高通滤波器提高荧光局域显微镜的分辨率.我们的分析是建立在矢量衍射理论基础之上的，结果显示，适当的高通滤波器可以使荧光显微取得超分辨效果.

1 模型和理论

在倏逝场的作用下荧光分子发出荧光.图1是荧光分子发出的荧光在光学成像系统中的传播路径.荧光分子置于物镜的焦点附近.ns、ng、ni分别为样本层、盖玻片、浸没层的折射率，L1和L2分别为物镜和筒镜，滤波器放在物镜和筒镜之间，探测器在焦平面附近.我们将荧光分子近似成电偶极子P=(sinθpcosφp，sinθpsinφp，cosφp)，其中θp和φp是偶极子的极角和方位角.偶极子的位置坐标为xp=(xp，yp，zp).荧光透过样本层、盖玻片、浸没层和物镜后的场强可表示为[7]：

(1)

依照矢量衍射理论，在成像空间探测面的场强可由Richards-Wolf积分[8-9]而计算出:

(2)

其中，A0是振幅系数，λ是荧光的波长，α是筒镜的半孔径角,Λ(θ;τ)是系统的像差函数[10]，x=(-rcosφd，-rsinφd，z)是观察点在柱坐标系中的坐标.将(1)式代入(2)式，并完成对φ角的积分，可得[8]:

(3)

其中

(4)

(5)

在方程组(3)中，Jm是第一类第m阶贝塞尔函数，k是波数.A(θ)是插入物镜与筒镜之间的高通滤波器的透过函数：

(6)

单分子探测面光强可写成|ε|2.由于荧光分子偶极子的取向具有任意性，所以我们假设荧光分子发射荧光在各个方向的概率相等，也就是说向各个方向发射荧光的机会均等，所以探测面的总光强为荧光单分子偶极子取向在整个空间各个方向上的积分，可表示为[7]：

(7)

2 计算结果

为了描述滤波器对荧光显微系统的光强分布的优化作用，我们使用3个参量：光斑大小增益G，斯特尔比S，边瓣强度M.G定义为加滤波器和未加滤波器时光斑大小(FWHM)的比值，当G<1时,滤波器具有超分辨作用；S定义为加滤波器和未加滤波器时中心光斑的最大强度之比，表征成像的亮度；M定义为最大的边瓣强度与中心光斑最大强度之比.由公式(7)看出总光强与方位角φ无关，因此总光强分布关于光轴中心对称.我们主要讨论滤波器对光斑大小的优化，因此，只计算在筒镜焦平面上的光强分布.在下面的计算中，我们假设系统为理想的光学系统，偶极子在物镜的焦点处，探测平面位于筒镜的焦平面，这样相差函数Λ=0.计算参数取为 ng=1.54, ni=1.515, λ=565nm, 物镜的数值孔径取为NA=1.45.

图2给出了ns=1.33时，G ,S ,M随滤波器的边界参数ε的变化.尽管在ε∈(0.02,0.4)区间内G因子小于1，其中ε=0.27附近光斑最小，但G因子非常接近1.此外，光斑的强度随着ε的增加迅速减小，边瓣强度随着ε的增加迅速增加.因而，在这种(ns=1.3比较小)情况下，滤波器实际上没有超分辨效果.

图2 当ns=1.33时，光斑大小增益G 、斯特尔比S、边瓣强度M随滤波器参数ε的变化

图3给出了ns=1.6时，G ,S ,M随边界参数ε的变化.ε∈(0, 1)整个区间内均可以实现超分辨(G<1)，并且当ε=0.75时，G(=0.873 6)最小，系统的分辨率提高了13%(G=0.873 6)，超分辨效果明显.从图3可以看到，超分辨的取得是以光斑强度的减小和边瓣强度的增加为代价.S的减小可以通过增加激发荧光的激光的功率来克服，也可以通过纳米金属薄膜增加激发荧光的倏逝场的强度来克服[7].如果限定M<0.15, 那么0<ε<0.59, 在这个范围内可以实现的最小光斑大小增益为G=0.885 8，此时S=0.272.此外，可以采用共焦的方法来减小边瓣强度[2].

图3 当ns=1.6时，光斑大小增益G 、斯特尔比S、边瓣强度M随滤波器参数ε的变化

3 结束语

本文分析计算了二区振幅型高通滤波器对荧光分子显微成像的超分辨作用.数值结果显示，当荧光分子所在的样本层的折射率比较小时，高通滤波器没有明显的超分辨效果，而对于大的样本层折射率，高通滤波器则可以产生明显的超分辨效应，分辨率可以提高10%以上，但是光斑强度减小，边瓣强度增加.将来进一步的工作是设计一些多区振幅或者多区相位滤波器来提高荧光分子显微镜的分辨率和光斑强度，同时减小边瓣强度.

参考文献

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[7] F Aguet, S Geissbuhler, I Marki,etal. Super-resolution orientation estimation and localization of fluorescent dipoles.using 3-D steerable filters[J]. Opt.Express ,2009,17(8):6 829-6 847.

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[9] B. Richards， E. Wolf. Electromagnetic diffraction in optical systems-II. Structure of the image field in an aplanatic system[C]. Proc. R. Soc. London. A , 1959, 253:358-379.

[10] S F Gibson, F Lanni. Experimental test of an analytical model of aberrationin an oil-immersion objective lens used in three-dimensional light microscopy [J]. Opt. Soc., 1991, 8(10):1 601-1 603.