张贵旺,史本康,王 平,刘屹立,李永智

(1冠县人民医院,山东冠县 252500;2山东大学齐鲁医院; 3中国医科大学附属第四医院)

Tadenan是非洲臀果木提取物,在临床上用于治疗良性前列腺增生(BPH)以及由于膀胱出口梗阻(BOO)导致的膀胱形态及功能改变,但其对糖尿病引发的膀胱功能障碍作用的研究尚未有所报道。2005年 5月 ～2007年 6月,我们建立糖尿病大鼠动物模型后,采用Tadenan干预,观察Tadenan对大鼠糖尿病膀胱组织中神经生长因子(NGF)及P物质的影响,为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康成年雄性Wistar大鼠36只,体质量(200±10)g,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,均饲养于山东大学实验动物中心SPF实验室。大鼠随机分为正常对照组(对照组)、糖尿病组、治疗组、药物对照组(药物组),前三组每组各 10只,药物组 6只。

1.2 糖尿病大鼠模型的制备及用药方法 糖尿病组和治疗组先建立糖尿病大鼠模型[1]。饲养 4周后,治疗组及药物组给予Tadenan 100 mg/(kg◦d),溶于2 ml花生油中,经胃管注入;对照组及糖尿病组大鼠给予同等剂量花生油赋形剂。以上动物共饲养 8周。8周后处死,完整切取膀胱组织。

1.3 主要试剂 RNA提取试剂盒(Trizol Reagent)、DL2000(50T)DNA Marke。NGF产物长度为505 bp;β-actin内参：正义链：5′-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3′;反义链：5′-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3′,扩增产物长度为101 bp。

1.4 膀胱组织中NGF及P物质检测方法 ①NGF检测方法：采用RT-PCR法检测标本中NGFmRNA。用Trizol试剂提取对照组、糖尿病组、治疗组大鼠膀胱组织总RNA,行变性胶电泳,检测总RNA的完整性,采用752紫外分光光度计检测样品中总RNA含量。分别取总RNA 10μg依次加入：5×Buffer 4μl、dNTP 2μl、MgCl24μl、Oligo dT 1μl、RNAse抑制剂0.5μl、莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶1 μl,用去RNAse水补齐,总计20μl,37℃水浴60min后,于95℃加热5min以终止反应。以第1链cDNA 2μl为模板,进行PCR扩增。反应条件：94℃预变性5min,94℃、20 s,68℃、20 s,72℃、1min,35个循环, 72℃延伸10min。4℃保存,反应产物取10μl进行1%琼脂糖电泳鉴定,Kodak凝胶成像系统分析电泳结果,其结果与内参的比值为各组NGF相对表达量。采用ELISA法测定标本中NGF蛋白。按ELISA试剂盒说明书操作。②P物质检测方法：四组膀胱组织经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,5～6μm厚连续切片,采用免疫组化SP法检测膀胱组织中P物质阳性纤维,操作按试剂盒说明书进行。每张切片随机观察 5～10个高倍视野,对 P物质阳性神经纤维数采用双盲计数。采用ELISA法测定标本中P物质蛋白表达情况。按ELISA试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行数据分析。所有数据以±s表示。组间比较用单因素方差分析和student′s t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠体质量及血糖水平比较 建模后,糖尿病组和治疗组大鼠体质量分别为(240.82± 10.32)、(245.76±9.87)g,明显低于对照组及药物组的(340.34±10.12)、(328.45±9.68)g(P均＜0.01);血糖分别为(25.46±4.45)、(25.41± 4.45)mmol/L,明显高于对照组及药物组的(4.36± 3.46)、(4.56±3.32)mmol/L(P均＜0.01)。证明建模成功。

2.2 四组膀胱组织中NGFmRNA表达及蛋白水平见表1。

表1 各组大鼠NGFmRNA表达及蛋白水平比较(±s)

表1 各组大鼠NGFmRNA表达及蛋白水平比较(±s)

注：与糖尿病组相比,＊P＜0.05;与对照组和药物组相比,＊＊P＜0.05

组别 n NGFmRNA NGF蛋白(pg/μg)对照组 10 0.766±0.213 73.541±5.628糖尿病组 10 0.350±0.253＊＊ 17.219±2.856＊＊治疗组 10 1.844±1.174＊ 54.632±4.735＊药物组 6 2.815±1.825 74.375±5.819

2.3 四组膀胱组织中P物质检测结果 见表2。

表2 各组膀胱组织中P物质阳性纤维密度及P物质蛋白水平比较(±s)

表2 各组膀胱组织中P物质阳性纤维密度及P物质蛋白水平比较(±s)

注：与糖尿病组相比,＊P＜0.05;与对照组和药物组相比,＊＊P＜0.05

组别 n P物质阳性纤维(个/HP) P物质蛋白(pg/μg)对照组 10 28.81±5.05 63.541±5.478糖尿病组 10 9.83±3.16＊＊ 10.219±2.647＊＊治疗组 10 20.75±4.60＊ 46.632±4.526＊药物组 6 29.32±5.75 64.375±5.723

3 讨论

糖尿病是临床常见的内分泌疾病,其对膀胱功能的损伤受到越来越多的关注。血糖升高状态下,糖代谢紊乱、植物神经发生病变,导致尿量增多、排尿反射减弱、膀胱容量增大、出现残余尿,由此而引起尿频、排尿不净、充溢性尿失禁、肾功能不全等[2]。但其膀胱功能损害的具体机制尚不清楚,因此目前的临床治疗缺乏针对性,效果不佳。

我们先建立糖尿病大鼠模型,观察糖尿病大鼠膀胱组织中NGF及P物质,同时观察Tadenan对糖尿病大鼠膀胱组织中NGF、P物质的影响作用。我们的数据显示,糖尿病组及治疗组大鼠的体质量及血糖指标完全符合糖尿病模型的要求,说明糖尿病大鼠模型建立成功。

NGF是一种多肽物质,主要存在于交感神经中,后者在膀胱分布丰富,其作用有以下几方面：①维持交感神经和感觉神经的生长发育及功能;②诱导轴突发芽、决定轴突的伸长时间,并可稳定神经结构、调节微丝蛋白的合成;③促进细胞分化及创伤愈合;④对神经细胞的凋亡有抑制作用[3]。高血糖状态下,NGF的表达呈时序性降低,促进了糖尿病膀胱病变进程[4,5]。本研究结果说明Tadenan能显著增强糖尿病大鼠膀胱组织中 NGF表达水平,降低高血糖对膀胱的损害,在一定程度上起到保护膀胱的作用。

P物质是一种受NGF调控的基因表达产物,是膀胱和尿道壁内组织传入神经纤维(感觉纤维)的重要组成部分,主要位于膀胱和尿道黏膜和黏膜下层组织内,传导疼痛、温度觉和触觉,在排尿过程中与感觉传入有关[6]。糖尿病状态下,NGF表达显著降低,势必导致其调控的膀胱组织中P物质水平下降[7]。本研究结果说明Tadenan能显著提高糖尿病大鼠膀胱组织中P物质水平,降低高血糖状态对P物质的损耗,从而在一定程度上减轻糖尿病对膀胱的损伤。

对于Tadenan能改善糖尿病对大鼠膀胱组织的损害的机制,目前尚无相关报道。本研究结果显示, Tadenan可上调NGFmRNA在正常大鼠膀胱组织中的表达,而对其蛋白水平和P物质无明显作用。国外有研究显示Tadenan在膀胱缺血再灌注及膀胱出口梗阻的动物模型中,能改善膀胱神经及肌肉中细胞膜及亚细胞器膜的损伤,降低线粒体及肌浆网的损害[8,9],结合Tadenan在其它模型中的作用及本次实验结果,我们考虑是否Tadenan通过对碱性成纤维细胞因子的抑制作用,改善逼尿肌内微细胞器内结构,增加NGF及P物质的表达,减轻糖尿病对膀胱感觉功能的损害。其机制待进一步研究。

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