张天禹,张琳刚,覃展偶,高 漓

(桂林医学院附属医院,广西桂林 541001)

膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一,其发病率在欧洲居第 5位,在美国居第 4位[1],在我国,男性膀胱癌发病率位居全身肿瘤的第 8位,女性排在第12位以后[2]。其中,膀胱尿路上皮癌占膀胱癌的90%以上[2,3]。其术后复发率高,为 50%～70%[4]。目前国内较常使用的药敏检测法是四唑蓝比色法(MTT法),但因其本身存在缺陷,使用受限。甲臜化合物(MTS)是MTT的一种新型类似物。2008年7月 ～2010年 4月,我们采用 MTS/吩嗪硫酸二甲酯(PMS)法检测原代培养的膀胱尿路上皮癌(下称膀胱癌)细胞对常用的 3种化疗药物的敏感性,为临床合理用药提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集在我院手术(电切者术前活检)治疗的 29例膀胱癌患者的新鲜肿瘤组织标本。29例患者中,男 23例,女性 6例;年龄 35～81岁,平均年龄60.5岁。膀胱癌分级：G1级11例,G2级 10例,G3级8例;临床分期：Ta期 10例,T1期 19例。初发 20例,治疗后复发 9例。术前均未进行放化疗。

1.2 药物及主要试剂 羟基喜树碱(HCPT)、吡柔比星(THP)、丝裂霉素C(MMC)。DMEM培养液,胎牛血清、MTS和PMS-20℃下避光保存,使用前将MTS标记液和PMS偶联剂解冻后以20∶1混合。1.3 原代细胞培养 将新鲜肿瘤组织标本用120目及200目钽网过滤,滤过液1 000 r/min、离心5 min,去上清,用PBS漂洗后加DMEM培养基,制成膀胱癌细胞悬液。

1.4 膀胱癌细胞药敏性检测 采用MTS/PMS法。将细胞悬液加入 96孔培养板中,150μl/孔,连续培养7 d,隔日换半液,设阴性对照孔和实验孔,每种药物均设3个复孔。置于 37℃、5%CO2培养箱培养24 h后,加入HCPT、THP、MMC(药物按临床用药量配制成试验用药量,相应剂量分别为 8、10、3 μg/ml)。培养20 h后,每孔加MTS/PMS混合液20 μl,经37℃、5%CO2培养4 h。测490 nm波长处吸光度值(A值)。

1.5 药敏评价标准及统计学方法 肿瘤细胞抑制率(IR)=(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值 ×100%[6]。根据 1978年全国抗癌药物会议制订的抗肿瘤药物通用指标[7],IR＞70%为高度敏感, 50%～70%为中度敏感,30%～49%为低度敏感,＜30%为不敏感或耐药。采用SPSS11.0软件。两两比较用t检验。P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

本组 29例膀胱癌标本中,获得药敏结果者 27例,可评价率为 93.1%(27/29)。失败的2例均是由于组织中大量死亡细胞导致活细胞数量不够所致。3种药物敏感性比较见表 1。

表1 27例膀胱癌原代细胞对 3种化疗药物敏感性比较

在有效的 27例膀胱癌原代细胞标本中,对 3种药物均高度敏感者12例(44.4%),对2种药物高度敏感者15例(55.6%);对2种药物中度敏感者3例(11.1%);对3种药物均耐药者 3例(3.7%),对2种药物耐药者2例(7.4%)。

3 讨论

目前MTT为抗癌药物筛选和临床肿瘤药敏试验的常用方法,但由于MTT经活细胞线粒体脱氢酶转化生成的蓝紫色结晶物需加入二甲基亚砜溶解后方能比色,操作步骤繁琐,且易影响结果的准确性。而MTS优点在于：①在PMS存在的条件下,可被活细胞线粒体中的多种脱氢酶还原形成极具水溶性的有色甲臜产物,省略了溶解过程,可减少人为的误差及工作量。②MTS法显色非常快,加入4 h后即可检测。③其颜色深浅与细胞株的活细胞数在一定范围内呈高度相关。④特异性强。MTS/PMS法形成甲臜产物为深棕色,影响因素较少。⑤安全,无需用挥发性的有机溶剂去溶解甲臜产物(不象MTT)。

根据本研究结果我们认为,采用MTS/PMS法检测不同个体膀胱癌原代细胞药敏性具有敏感、特异的特点。因为癌细胞刚刚离体,生物学性状尚未发生很大变化,能较真实地反映整个肿瘤细胞群体的特性及不同个体的差异,在一定程度上能代表体内状态[8,9]。

在本研究 29例膀胱癌标本中,获得药敏结果者27例,可评价率为93.1%(27/29)。失败的2例均是由于组织中大量死亡细胞导致活细胞数量不够所致。其中HCPT抗癌活性最强,明显优于THP和MMC;MMC耐药性最强。有效的27例膀胱癌原代细胞标本对 3种药物均高度敏感者 12例(44.4%),对2种药物高度敏感者15例(55.6%);对2种药物中度敏感者3例(11.1%);对3种药物均耐药者 3例(3.7%),对2种药物耐药者2例(7.4%)。说明来源于不同个体的膀胱癌细胞在药物敏感方面具有异质性,提示进行肿瘤个体化治疗非常重要。

综上所述,采用MTS/PMS法检测膀胱癌原代细胞化疗药物敏感性具有敏感、特异等优点,可应用于膀胱癌的体外药敏检测。而不同个体的膀胱肿瘤具有异质性,因此应根据MTS/PMS法所检测的药敏结果,制订个体化膀胱癌化疗方案。

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