张 红，马 博

（1.广西医科大学研究生学院，广西南宁 530021；2.广东公安边防总队医院生殖中心，广东深圳 518029）

上游法是较早用于分离精子的技术之一，由于其操作简便也是现在多数生殖实验室使用的精子优选方法[1]。上游法的原理就是活力高的精子可以从离心后的精液沉淀中游出至上层的培养液中[2]。随着辅助生殖技术的不断发展，优选精子的上游法也有了其衍生方法。本研究主要比较两种改良上游法对IVF的受精结果的影响。第一种上游法为：将精子洗涤液（美国 Quinn's）与精液1∶1充分混匀，若精液不液化，则反复吹吸使之液化，然后置于15 ml离心管中，用700×g离心力，离心5 min，离心后去上层液体，将精液沉淀吸出后缓慢置于装有0.5 ml卵裂液HTF（美国 Quinn's）的5 ml试管底部，然后放置于5%二氧化碳，37℃温箱中培养15～25 min后将上悬浊液吸出放于另一无菌的5 ml小试管，待用。此种上游法简称先离心法，其优点是：操作简单，节省试验耗材，能最大程度地回收精子。缺点是：离心后高密度的有缺陷的精子及白细胞会产生高浓度的活性氧，进而使正常精子受到损害[3]，而且在吸取上悬浊液时容易混入死精子及其他杂质。第二种上游法：取3～4支10 ml圆底试管，每支试管加入1.5 ml精子洗涤液，将精子洗涤液与精液1∶1混匀并反复吹吸，然后将精液分为2～3等份，分别缓慢地加入圆底试管底部，然后将含精液试管倾斜45°，置于5%二氧化碳，37℃温箱中培养30～45 min，培养后将各管上悬浊液吸入15 ml离心管中，以700×g离心力离心5 min，离心后弃去上清液，以0.3～0.4 ml卵裂液HTF与沉淀混匀，待用。此种上游法简称先上游法，优点是：减少了异常精子及精浆中的其他杂质对正常精子的损伤；缺点是：操作较复杂，对精子密度要求高。此两种方法均较传统的上游法[4]减少了离心次数，而离心可能对精子产生损伤[5]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

对2009年2～9月因输卵管因素不孕在广东公安边防总队医院生殖中心接受辅助生殖治疗的患者进行相关研究分析，为排除干扰因素我们选取夫妇双方年龄均＜40岁，符合体外受精（in-vitro fertilization，IVF）指征，获卵个数不少于6个，男方精液量不少于2 ml，共287周期进入此项研究，女方年龄 25～37（29.5±3.5）岁，男方年龄 25～39（31.5±3.2）岁，不孕年限 4～13（8.0±3.1）年，男方精液检查依照世界卫生组织诊断标准，均为正常。

1.2 方法

1.2.1 临床技术 所有周期均采用常规促排卵方案，前1个月经周期第 21 天开始降调，达菲林（法国 Signes）0.8～1.5 mg 肌注，月经周期第3天查性激素卵泡生成素、黄体生成素、雌二醇达到降调标准后用果纳芬（瑞士 Sereno）或丽申宝（丽珠医药）促排卵，当超声检查见1个直径≥18 mm或2个直径≥16 mm的卵泡时当晚22∶00时给予HCG 8 000～10 000 IU肌注，34～36 h后经阴道超声引导下取卵。

1.2.2 实验室技术 将取出的卵子分为数量约等的两份，均放于5%二氧化碳，37℃温箱中培养3～6 h，再将已经调整为相似密度的两种改良上游法优选过的精子分别与两组卵细胞共培养。16～18 h后观察受精情况，并每隔24 h观察胚胎分裂情况至移植当天，以胚胎卵裂球数≥6，卵裂球大小均匀，碎片＜10%的胚胎为优质胚胎[6]。

1.2.3 观察指标 分别观察两组的正常受精率、卵裂率及优质胚胎率

1.3 统计学分析

2 结果

将使用先离心法分离的精子行IVF产生的A组受精卵与使用先上游法分离的精子行IVF产生的B组受精卵进行比对，A组有14个周期完全受精失败，其中原发不孕9个周期，继发不孕5个周期，有1 472个卵子行IVF，受精率为72.4%（1 066/1 472），卵裂率为 91.2%（972/1 066），优质胚胎率为52.5%（510/972）。B组中有12个周期完全受精失败，其中原发不孕8个周期，继发不孕4个周期，有1 493个卵子行IVF，受精率为 75.1%（1121/1493），卵裂率为 93.2%（1045/1 121），优质胚胎率为53.9%（563/1 045）。虽然B组中各项结果较A组好，但两组中受精率、卵裂率、优胚率的差异并无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

胚胎的质量是决定不孕患者能否通过辅助生殖技术（ART）成功受孕的主要因素之一，而精子和卵子的质量又决定了胚胎的质量。由于胞浆内单精子注射技术（ICSI）的出现，临床医生过多地关注卵子的质量，而忽略了精子在受精过程中的重要作用。现在随着男科学的不断发展，精子对胚胎质量的影响越来越多地被临床医生认识和了解，如何更简便地获得优质的精子，也是生殖领域的研究人员在不断探索的问题。在优选精子的方法中上游法既操作简单又能完全实现从精浆中分离活动精子，提高活动精子密度，使精子获能等分离精子的目的，而由传统的上游法衍生的改良上游法更是明显地体现了上游法的优点并为多数生殖实验室所使用。

本研究对使用两种不同的上游法分离的精子进行IVF操作，并对受精结果进行分析。虽然B组的受精率、卵裂率、优胚率等三项指标均高于A组，但未发现有统计学意义，这与文献[3]报道有不同，究其原因可能为先离心法在离心及温箱内上游时间均短于相关文献使用的时间，减少了正常精子与异常精子及精浆的接触时间，或者是本研究的标本数不足，没有发现统计学上的差异。由于现在越来越多的证据显示高浓度的死精子、未成熟精子、异常精子、精浆杂质和白细胞会严重影响损伤正常精子[3，7]，并有学者认为采用先离心再上游的方法获得的精子行IVF有可能是导致完全不受精的原因[8]，并且IVF治疗周期长，费用高，因此在现有的条件下尽量减少对精子和卵子的损伤也是生殖实验室工作人员必须要注意的。

[1]汤慧.治疗不孕症精子体外处理上游法和Percoll梯度离心法比较[J].淮海医药,2009,27(4)∶57-59.

[2]李媛.人类辅助生殖实验技术[M].北京∶科学出版社,2008∶71.

[3]刘容菊,李志凌.辅助生殖技术中预防活性氧对精子的损伤[J].生殖与避孕,2007,27(3)∶213-217.

[4]Mahadevan M,Baker G.Clinical in vitro fertilization[M].Berlin∶Springer,1985∶83-97.

[5]王娜.活性氧类物质对精子DNA的损伤及其检测[J].中国医药导报,2009,6(12)∶11-12.

[6]黄荷凤.现代辅助生育技术[M].北京∶人民军医出版社,2003∶232-233.

[7]Ashok A,Rakesh KS,Kiran PN,et al.Reactive oxygen species as an independent marker of male factor infertility[J].Fertility and Sterility,2006,79(4)∶878-885.

[8]Mortimer D.Sperm preparation techniques and iatrogenic failures of invitro fertilization[J].Human Reproduction,1991,6(2)∶173-176.