马玉强 张明辉

(唐山市人民医院肿瘤医院,河北 唐山 063000)

树突细胞(DC)是体内功能最强的抗原递呈细胞,在机体抗肿瘤免疫应答的诱导中发挥重要作用〔1〕。研究发现,将肿瘤患者外周血单个核细胞分离后在体外采用相关的细胞因子进行活化,然后加入自体肝癌细胞裂解物致敏,将致敏的DC与自体 T淋巴细胞共培养后,诱导产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫,发挥抗肿瘤免疫效应〔2〕。DC瘤苗抗肿瘤研究正成为肿瘤生物学治疗的新热点。近期研究表明,肿瘤患者DC免疫功能低下〔3〕。如果制备 DC瘤苗回输患者体内,可激发针对肝癌抗原细胞的 T淋巴细胞免疫,有望在肝癌术后的治疗中发挥作用。为此,我们应用肝癌细胞裂解物致敏的DC瘤苗,观察刺激术后与术前自体T淋巴细胞增殖能力及抑制肿瘤细胞免疫作用的情况,为肝癌 DC瘤苗用于肝癌患者术后的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2007年 10月至 2008年 9月唐山市人民医院收治的肝癌患者 8例,均无远处转移灶,无严重脏器功能不全,术后病理活检为肝细胞性肝癌。

1.2 方法

1.2.1 肝癌细胞及其裂解物的制备 将手术切除的肝癌组织剪碎,经胶原酶Ⅳ、DNA酶消化后制成细胞悬液,用 100%和75%的淋巴细胞分离液分离,收集管底的肝癌细胞,将 5×106自体肝癌细胞在-70℃和 37℃下,反复冻融、筛网研磨、离心和经超声破碎,取上清液经 0.2μm滤膜过滤即为肝癌细胞裂解物,冻存备用。

1.2.2 DC体外培养、扩增及鉴定 取肝癌患者术前与术后外周血各 50ml,肝素抗凝,常规分离外周血单个核细胞(PBMC),放置 37℃,5%CO2孵箱中培养 2 h后,吸出未贴壁细胞,留下贴壁细胞,加入含 rhGM-CSF 1 000 U/ml和 rhIL-4 500U/ml等细胞因子的培养液,隔日加细胞因子(首次浓度的 1/2)和培养基,培养 7d收集的细胞即为树突状细胞。

1.2.3 肝癌细胞裂解物致敏DC的制备 在肝癌患者外周血DC体外培养的第 6天,加入肝癌细胞裂解物(120μg/ml)共培养,过夜收获贴壁的细胞即为致敏DC瘤苗。

1.2.4 T淋巴细胞制备 取肝癌患者术前与术后外周血各100ml,分离PBMC,置 37℃、5%CO2培养箱孵育 3h,去除贴壁细胞,非贴壁细胞用含 5%AB型血清的 RPMI1640悬浮,注入尼龙毛柱,37℃孵育 1h,冲洗出非黏附细胞即为T淋巴细胞。

1.2.5 肝癌DC瘤苗对自体T淋巴细胞增殖的影响 收集诱导第 8天的术前负载肝癌抗原的肝癌 DC瘤苗,调整细胞浓度为 1×105/ml,加入丝裂霉素 C 25μg/ml,37℃孵育 45 min,PBS洗 3次,完全培养基悬浮,然后与术前自体 T淋巴细胞(1×106细胞 /孔)按 1∶10的比例混合,铺 96孔培养板(200μl/孔),同时设自体 T淋巴细胞(106细胞/孔)对照,置 37℃、5%CO2孵箱培养 48h,加入 MTT(5 mg/ml)10μl继续培养 8 h。轻轻吸弃培养上清,加入 DMSO 100μl/孔,于 570nm处测定 A值。按公式计算 T淋巴细胞及CD8+T细胞增殖指数;同理,再将收集培养的术后肝癌DC瘤苗与术后提取的自体T淋巴细胞按以上实验操作,计算增殖指数。增殖指数(%)=实验组 A值/对照组 A值(%)。

1.2.6 肝癌DC瘤苗刺激自体 T淋巴细胞分化为CTL及CTL对自体肿瘤细胞杀伤活性检测 于 6孔板中加入术前自体 T淋巴细胞(1×106细胞/孔)、术后肝癌 DC瘤苗(1×105细胞/孔)以及 IL-2 200U/ml,置 37℃、5%CO2孵箱中培养,分别于培养的第 3、6天换液、扩增,收集第 4～6天培养 72h的上清备用。第 7天收集细胞,即为 CTL。流式细胞术检测 CTL分型、采用乳酸脱氢酸(LDH)4 h释放法检测 CTL的杀伤活性。以CTL作为效应细胞,以自体肝癌细胞为靶细胞,效靶比为 25∶1,同时设效应细胞和靶细胞对照孔。置酶标仪测 490 nm的OD值,按公式计算CTL的杀伤率。以反映肝癌DC瘤苗及其活化CTL对肝癌细胞的作用。杀伤率(%)=(OD实-OD空)-(OD效-OD空)-(OD靶-OD空)/(OD靶最大释放-OD靶校对)-(OD靶自然释放-OD空)×100%。

1.3 统计学方法 应用 SPSS12.0统计软件进行统计分析。结果以 x±s表示,两组均数比较用 t检验。

2 结 果

2.1 肝癌DC瘤苗对自体T淋巴细胞增殖的影响 将负载肝癌抗原的肝癌 DC瘤苗与术前及术后自体T淋巴细胞共培养后,用流式细胞仪检测T淋巴细胞增殖情况,肝癌DC瘤苗刺激术后自体 T淋巴细胞增殖能力及抑制肿瘤细胞作用显著强于对术前自体 T淋巴细胞的作用,T淋巴细胞增殖指数术后(1.86±0.15)较术前(1.18±0.13)显著增高、CD8+T细胞增殖指数术后(1.55±0.35)较术前(0.95±0.12)增加显著,差异均有统计学意义(均P＜0.05)。其中 T淋巴细胞亚群 CD8+T细胞增加显著,肝癌DC瘤苗刺激术后自体 T淋巴细胞增殖指数显著强于刺激术前自体T淋巴细胞,差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 肝癌DC瘤苗及其活化CTL对肝癌细胞的作用 未加肝癌 DC瘤苗培养的肿瘤细胞状态良好,呈进行性生长,肝癌 DC瘤苗活化的术前自体CTL对自体肝癌细胞杀伤率,与肝癌 DC瘤苗活化的术后自体 CTL对自体肝癌细胞杀伤率比较显示,肝癌 DC瘤苗活化的术后自体 CTL对自体肝癌细胞有较强杀伤作用,杀伤率由术前的(32.35±2.26)%增加到术后的(69.80±3.45)%,肝癌DC瘤苗活化的术后自体 CTL对自体肝癌细胞有较强杀伤作用。而二者对自体二倍体细胞无明显杀伤作用(术后为 1.59±0.55)。

3 讨 论

在肿瘤患者微环境下,肿瘤细胞通过分泌某些细胞因子对DC产生功能抑制,如血管内皮生长因子(VEGF)有胚胎发育过程中,在肿瘤新生血管生成过程中起了关键性作用。实验证明,许多肿瘤能分泌VEGF,VEGF在体内体外均能导致DC的分化及功能缺陷〔4〕。 Rinaldi等〔5〕证实,肿瘤细胞表达相关抗原 GA 733-2,影响局部浸润的 DC表面 MHC-Ⅱ类分子的表达,从而影响 DC对 T细胞抗原的递呈和激活。Xie等〔6〕在对肝癌的研究中发现,由于血清甲胎蛋白(AFP)的存在,肿瘤组织中浸润的 DC表面不表达 CD86,CD80和 CD40,不能有效递呈肿瘤抗原。Holmstrom等〔7〕研究发现肝脏 DC的 TLR4 mRNA的表达降低,如果将肿瘤局部浸润的 DC在体外用 GM-CSF及TNF或 CD40L刺激,DC不表达 CD80,CD86等共刺激分子,呈现未成熟 DC的表型特征,因此,DC在分化过程中存在缺陷。DC数量少,在肿瘤患者早期的外周血中DC的含量可比正常人少一半以上,而在晚期患者这种差异可达 4倍以上,单纯这种数量的降低即可使肿瘤细胞免疫刺激变得相对没那么有效〔8〕。

当肿瘤细胞被切除后,患者体内抑制DC成熟的各种因素作用减弱,机体内DC分化及功能逐渐恢复正常,最直接的证据是当肿瘤被切除后,抑制单核细胞分化发育的微环境被解除,单核细胞可以正常分化为未成熟DC,这时未成熟DC遇到肿瘤抗原后,其表面表达 MHC-Ⅱ类分子以及 CD40,CD80,CD86等共刺激分子增加,IL-12分泌增多,即成为成熟 DC〔9〕。成熟的DC常表达CC趋化因子受体 7(CCR7),它的表达增加有利于DC向引流淋巴结迁移,在那里DC能遇到初始T淋巴细胞并诱导免疫反应的发生〔10〕,只有成熟 DC能刺激初始型 CD4+T淋巴细胞,通过 TH1细胞分泌细胞因子 IL-12,IFN-γ,TNF等参与细胞免疫的调节,能够激活CD8+T细胞又称为CTL,直接发挥细胞毒作用,杀伤肿瘤细胞,通过分泌释放效应细胞因子如穿孔素,颗粒酶,淋巴毒素,TNF等引起靶细胞裂解或凋亡〔9〕。故术前肝癌患者体内,肿瘤细胞分泌的细胞因子对树突细胞的分化和发育影响较大,而术后肝癌患者体内肿瘤细胞分泌的细胞因子对树突细胞的影响较小。同时肿瘤可诱导 T细胞成分和功能紊乱,有人研究分析荷瘤小鼠的胸腺中 T细胞亚群的比例失衡,细胞免疫功能异常,而且淋巴因子的功能亦可发生失调,Th1可分泌 IL-2,IFN-γ等细胞因子,参与细胞免疫调节,激活CD8+T细胞,增强其杀伤能力,或促进靶细胞 MHC-1类分子的表达,提高其对CTL的敏感性,抗肿瘤免疫应以 Th1型细胞介导的细胞免疫为主〔11〕,Th-2分泌 IL-4,IL-10等细胞因子,IL-4,IL-10是抑制 Th1应答和介导 Th2发育的主要细胞因子,yamamura和kharkevitch最早发现肿瘤患者体内 Th2型细胞因子较 Th1型细胞因子处于优势状态,也就是说肿瘤患者体内术前较术后 Th2型细胞因子处于优势状态;经手术后,肝癌患者体内肿瘤抑制因子含量明显减少,用肝癌抗原刺激 DC,其表面可更多表达 MHC-Ⅱ类分子以及 CD40,CD80,CD86等共刺激分子,IL-12分泌更多,刺激 CTL的杀伤作用更强,使负载肝癌抗原的DC瘤苗对自身T淋巴细胞的激活作用,术后较术前效果显著。

本实验结果显示,肝癌DC瘤苗刺激术后自体 T淋巴细胞增殖能力及抑制肿瘤细胞作用显著强于对术前自体 T淋巴细胞的作用,T淋巴细胞增殖指数较术前显著增高,CD8+T细胞增殖指数较术前增加显著,而且肝癌 DC瘤苗活化的术后自体CTL对自体肝癌细胞有较强杀伤作用,证明肝癌DC瘤苗活化的术后自体 CTL对自体肝癌细胞的杀伤力明显强于对术前CTL杀伤自体肝癌细胞的能力。

目前,肝癌的治疗方法有手术、放疗和化疗,HCC根治术后,常因不能清除远处转移的微小病灶而易造成复发和转移,化疗或放疗又摧毁了机体的免疫功能,而DC是体内功能最强的抗原递呈细胞,在抗肿瘤免疫中发挥重要作用,目前由于肝癌特异性抗原尚不能明确鉴定〔11〕,制备 DC瘤苗回输患者体内,可激发针对多个肝癌抗原的 T淋巴细胞免疫,减少了癌细胞逃逸的可能性,肝癌的生物治疗在保护机体的免疫力的同时可以清除易造成转移和复发的远处微小病灶,副作用不显著,成为继手术、放疗、化疗后发展起来的肿瘤治疗第 4大疗法,本研究证实了肝癌的生物治疗最好用于肝癌术后的患者效果更好。

1 Svane I M,Berntsen A,Trepiakas R,et al.Dendrite cell-based cancer vaccines-clinical application〔J〕.Ugeskr Laeger,2006;168(14):1415-20.

2 Lange C,Durr M,Doster H,et al.Dendritic cell-regulatory T-cell interactions control self-directed immunity〔J〕.Immunol Cell Biol,2007;85(8):575-81.

3 李明松,袁爱力.人肝癌细胞系 HepG2上清液抑制树突状细胞免疫功能〔J〕.中华内科杂志,1998;37(12):823-5.

4 Pichard V,Royer PJ,Richou P,et al.Detection,isolation,and characterization of alpha-fetoprotein-specific T cell populations and clones using MHCclass I multimer magnetic sorting〔J〕.J Immunother,2008;31(3):246-53.

5 Rinaldi M,Iurescia S,Fioretti D,et al.Strategies for successful vaccination against hepatocellular carcinoma〔J〕.Int JImmunopathol Pharmacol,2009;22(2):269-77.

6 谢裕安,匡志鹏,梁安民,等.甲胎蛋白基因转染树突状细胞瘤苗对诱发性小鼠肝癌发生发展的免疫抑制作用〔J〕.中国肿瘤杂志,2008;30(4):250-4.

7 Holmstrom K,Pedersen AW,Claesson D,et al.Identification of a microRNA signature in dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy〔J〕.Hum Immunol,2009;8.[Epub ahead of print].

8 Zeng Z,Yao W,Xu X,et al.Hepatocellular carcinoma cells deteriorate the biophysical properties of dendritic cells〔J〕.Cell Biochem Biophys,2009;55(1):33-43.

9 Palmer DH,Midgley RS,Mirza S,et al.A phaseⅡstudy of adoptive immunotherapy using dendritic cells pulsed with tumor lysate in patients with hepatocellular carcinoma〔J〕.Hepatology,2009;49(1):124-32.

10 Hartigan AJ,Westwick J,Jarai G,et al.CCR7 deficiency on dendritic cells enhancesfungal clearance in a murine model of pulmonaryinvasive aspergillosis〔J〕.J Immunol,2009;183(8):5171-9.

11 Yin XY,Wang L,Lu MD,et al.Induction of specific cytolytic T lymphocytes using fusions of hepatocellular carcinoma(HCC)patient-derived dendritic cells and allogeneic HCCcell line〔J〕.Hepatogastroenterology,2008;55(81):155-9.