任玉鹏，王利娜，颜其贵*，郭万柱，王小玉，韩国全

（1.四川农业大学动物医学学院，四川 雅安 625014；2.成都市产品质量监督检验院，四川 成都 610041；3.四川农业大学动物营养研究所，四川 雅安 625014）

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（Porine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪肠道传染性病毒病。目前PED 仍然以其与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PRV）腹泻的病原特性和临床症状相似度高难于诊断及相互混合感染加大发病情况的复杂程度，给疾病防控工作和实验室研究带来较大困难。此外，还有报道其能与诸如圆环病毒之类病毒混合感染[1]，使发病情况显得更为复杂。本文主要从流行病学、临床综合诊断、实验室诊断、疫苗研究等方面，浅谈猪流行性腹泻预防与控制。

1 流行病学

PED 仅发生于猪，各种年龄的猪只都能感染。本病多发生于寒冷季节，受气温骤变、天气寒冷、气候突变时易发生，尤其冬季多发，春、秋也有小规模流行发生，夏季亦有零星流行发病的报道。哺乳仔猪、架子猪、育肥猪的发病率高达100%，尤以哺乳仔猪的危害最为严重。成年母猪发病率10%～90%，且流行速度快，发病急。病猪是主要传染源，病毒存在于其肠绒毛和肠系膜淋巴结中，随粪便排出后，污染环境、饲料、饮水及用具等而感染，在发病规律上，其途径主要经消化道。常常是大猪舍首发，发病后病猪水样腹泻，粪便呈草绿色，有恶臭，随后诱发全群腹泻，继而波及相邻猪舍并引起全场或某一地区相继感染发病。乳猪病程较长，危害最大，发病后处理不当，死亡率可达100%。

我国PED 发生流行依然普遍，并呈现逐年上升的趋势。1992 年程庆华等[2]针对青海地区PED 流行情况的调查报告显示，自1987 年到1990 年青海省多个地区均出现PED 流行，虽然3年间在老疫区发病率有所降低，但死亡率却逐年增加，这也表明在20 世纪90年代，该病就对我国养猪业发展造成阻滞；而2004 年杜坚等[3]对广西6 市6猪场进行采样调查，经统计分析发现被调查猪场发病率多在42%以上，且有猪场还出现阳性带毒情况；而在邢志强等对内蒙古乌盟集宁市周边地区猪场的传染性腹泻情况调查报告中显示引起腹泻的主要病原仍是PEDV 或TGEV，而在一些应用了TGE-PED 二联灭活苗猪场，该病得到有效控制；2007 年张世忠等对福建地区仔猪腹泻病进行病因调查发现，病毒病是仔猪腹泻的主要病因，而PEDV 在其中占到7.1%；近两年文献报告也相继有该病发病且引起猪只死亡的报告，笔者在仔猪流行性腹泻病例中，常检测到PED 抗原阳性结果，目前已经成为我国猪场腹泻病中，较为重要的疾病之一。

2 临床综合诊断

本病在流行病学和临床症状方面与猪传染性胃肠炎（TGE）、轮状病毒（RV）感染无明显差异，都是有呕吐、腹泻和失水为特征，但流行性腹泻更具明显的季节性（多发生于寒冷季节）。临床上多以混合感染形式出现。因此，在兽医临床综合诊断方面，难度较大，常常需要排除症状比较接近的病原。

本病与轮状病毒感染的区别在于：主要发生在哺乳期的仔猪，7 日龄以下不发病，多发生于13 日龄～39 日龄猪；出现下痢，粪色暗黑或黄白色，较腥臭，粪便呈酸性(细菌性腹泻的粪便一般为碱性)，持续2～4 d。若无继发感染，死亡率不会超过10%。病变主要表现为胃充满乳凝块和乳汁，大小肠黏膜呈条状或弥漫性出血，肠壁黏膜易脱落，肠壁变薄。

本病与猪传染性胃肠炎的区别在于：不同年龄的猪只都可暴发感染本病。临床上以呕吐、严重腹泻、少食或不食、脱水、酸碱平衡失调以及仔猪的死亡率高为特征。哺乳仔猪典型症状是突然发生呕吐，随后迅速发生剧烈腹泻，呈黄色、淡绿色或灰白色水样粪便，内含未消化的凝乳块，气味腥臭并迅速脱水，一般于腹泻2～5 d 内死亡，初生仔猪感染本病死亡率达90%，10 日龄以内仔猪的平均死亡率高达50%～100%。

3 实验室诊断

当前我国养猪业发展迅速，然而由于地区差异等原因，养猪业水平、规模参差不齐，疫病发生流行比较复杂，非典型症状严重干扰临床综合诊断的准确性。因此，对于PEDV 确诊需要更加精确的实验室诊断，国内外针对于猪流行性腹泻病毒的新型诊断技术主要包括免疫学和分子生物学方法，简要综述如下。

3.1 免疫学诊断

免疫学诊断技术即是利用抗原抗体特异性结合的原理对病原进行检测。而针对PEDV 诊断的现存方法，主要有免疫荧光法、病毒中和试验、ELISA 法等。在早期主要应用直接免疫荧光法和病毒中和试验来对PEDV 进行研究和诊断：如Hofmann 等[4]就利用成熟的免疫荧光技术，对被PEDV 感染的Vero细胞进行染色观察，并发现了其细胞质内特有的荧光性。我国学者林志雄等利用野毒自行培育细胞适应株作微量中和试验，并用本方法对5 个猪场进行血清学调查。该方法可准确地区别TGEV和PEDV，有助于指导生产单位采取相应的防治措施，也可作为对进出境猪检疫的诊断方法。而随着生物技术的不断发展，ELISA 试剂盒的开发和针对于ELISA 技术的更有效的病毒抗原性基因的研究工作越来越受到重视。

早在1990 年Hofmann 等[5]就利用20%～40%的蔗糖作缓冲液，通过超速离心收集纯化PEDV 细胞毒作抗原，研究出一种ELISA 诊断法。后将该方法同间接荧光免疫法对比应用于1 024个猪血清样本检验，显示出ELISA 法高度特异和及其灵敏的优势，该方法成为当时较为便捷有效地针对PEDV的 检 测 途 径。1992 年Knuchel 等 尝试性的对通过S 蛋白和N 蛋白分别建立的ELISA 方法进行比较探索，发现S-ELISA 法，比N-ELISA 法 在 免 疫测定中显得更为有效，在被感染猪中病毒S 蛋白产生的抗体，在较长时间后依然能被监测到，比N 蛋白更为敏感。并通过实际生产检验证实，应用了该方法对猪场进行疾病监测的瑞士猪场，只有一小部分发生了PEDV 感染。而近年来，对利用N 蛋白建立新的ELISA 法的研究工作也在不断开展。如我国学者林厚新等将N 基因连入原核表达载体，在大肠杆菌中表达，并利用组氨酸标记进行纯化收集重组质粒表达的蛋白，包被抗原建立ELISA 诊断法，其特异性和敏感性分别达到98.7%、98%，为养殖场对PEDV 抗体检测提供了又一便利的途径；姜艳平等则用IPTG 诱导pPROHTa-N 表达质粒转化的重组菌大肠杆菌BL21，产生的N 蛋白用镍柱纯化后，进行了Western blot、dot-ELISA、间接ELISA等免疫学实验分析，发现N 蛋白做检测抗原具有可行性，且与全病毒进行比较发现,以PEDV全病毒作为抗原检测阳性血清和以重组N 蛋白为抗原检测阳性血清相比的OD 值较高，以重组N 蛋白为抗原的P/N 值达8.28。试验证实了该方法重组的N 蛋白是代替全病毒作诊断抗原的良好选择。

3.2 分子生物学诊断

通过分子生物学诊断，则主要是基于 RT-PCR（RNA 逆转录后的聚合酶链式反应）技术，对该病毒中的一些保守性好，特异性高的基因设计引物，扩增相应基因，从而达到鉴定目的。虽然单纯的RT-PCR 技术建立的诊断方法，普遍具有快速、灵敏、高效等特点，但也存在不易对基因组相似度较大病毒进行区分以及存在一定假阳性的可能。通过研究工作者不断探索，也出现了多重RT-PCR、荧光定量PCR 等准确性、特异性、灵敏性、效率更高的检测方法，给实际生产中的PEDV 预防控制带来了有效保障。

目前多研究中以N 基因作为RTPCR 的目的基因者相对较多。陈建飞等[6]通过对CH/S 株 PEDV 的N 基因设计引物，扩增条带，并作生物信息学分析发现，该基因与其他多个不同毒株的同源性均在95%以上，证实了该基因较强的保守性，为以该基因对PEDV 建立分子生物学诊断方法奠定了基础。田小艳等[7]在针对PEDV N 基因设计引物的同时，对TGEV、PRV 设计引物作RT-PCR 扩增，用PEDV-TGEVPRV 三联弱毒疫苗作为阳性对照，优化条件，建立了多重RT-PCR 诊断方法；刘邓等基于N 基因保守性良好的这一特点出发，对其设计引物和探针，并以克隆N 基因的质粒作阳性标准品，建立了一种快速检测猪流行性腹泻病毒含量的TaqMan 荧光定量PCR 方法，该方法具有极高特异性，设计合成的探针中即使只有一个碱基发生突变也可阻断荧光信号的激发。该方法在40 个循环内即可检测到10 copies/μL 的质粒DNA，与常规RT-PCR 方法相比其敏感性提高了10 倍。研究者用该方法和琼脂糖电泳检测扩增产物对比，对采集样品进行检测，结果表明，前者阳性检出率92%，后者仅80%且部分为假阳性。通过该研究证实了TaqMan 荧光定量RT-PCR 方法具有准确定量、灵敏度高特异性强等优点，在对PED 诊断与防治的实际应用上有很高的价值。

除N 基因外，PEDV 的E、M、S等基因或基因的部分保守区域也被用于建立分子生物学诊断方法。刘矿等[8]就以PEDV 的E 基因为目的基因，并同时对TGEV 设计引物，用TGE-PED 二联苗作模板同时扩增2 种病毒目的基因，初步建立了针对PEDV、TGEV 的多重RT-PCR 诊断方法。该方法能检测到的最小RNA 量为20 pg。应用于临床上便捷有效。Kim等[9]通过对 PEDV M基因，TGEV N 基因设计引物，建立了一种双重PCR 检测方法，对5 份临床病料进行检测，正确率达 100%；张坤等则在此基础上根据 PEDV M 基因、TGEV N 基因、GAR VP7 基因设计3 对引物，探索出了1 种能同时检测 PEDV、TGEV和GAR 的多重RT-PCR 方法，并将这种方法和常规的RT-PCR 进行了比较。结果表明该方法检测PEDV、TGEV、GAR 的 敏 感 性 分 别 为92%、100%、100%，特异性均为100%。由此为实际生产中，针对3 种病的防治检测工作提供了又一高效、敏感的新方法。赵雯雯等针对PEDV 和TGEV 的S 基因部分保守区段分别设计特异性引物，也建立了基于2 种病毒的多重RT-PCR 诊断方法，为针对2 种病原的检测、流行病学调查等奠定基础。

3.3 PED 诊断技术方法的比较研究

综上所述，国内外研究人员基于免疫学或分子生物学原理，建立诸多的PEDV 新型诊断技术方法，给予临床预防控制 PED 有效保障。随着分子生物学的快速发展，早期建立的行之有效诊断技术显示出不足之处。Kim 等[10]将针对PEDV 的RT-PCR 法、免疫组织化学法、原位杂交法进行了比较分析，发现通过对自然感染的腹泻猪只分别利用上述3 种方法检测，其中免疫组化法检出69%～87%的样品为 PEDV 阳性，72%～91%的样品被原位杂交法检为阳性，而 RT-PCR 法检出了 73%～92%的阳性样品；3 种方法的结果一致性达到83% ，证明上述3 种方法，均可独立的对PEDV 感染做出最初较准确的判断；研究结果显示，免疫组织化学和原位杂交法更有利于福尔马林固定的PEDV 感染的肠道组织的确诊。关于高效、敏感的RT-PCR 诊断技术，早期研究人员认为检测敏感性受肠道或粪便中抑制因子的影响比较大；笔者通过对本实验室检测结果深度分析显示，以最佳试验条件与合格的分子生物学试剂进行试验操作，基本可以避免上述情况。RT-PCR 方法是目前最为便捷、灵敏、有效的实验室快速检测技术；除此外，ELISA 方法也以其快速、灵敏、特异的优点受到青睐，在实际生产中，主要利用此法对猪场血清抗体水平进行监测，从而辅助兽医工作者制定更为可取的免疫途径。

4 疫苗研究

在PED 发现早期的很长一段时间，人们采用被感染猪的粪便或带PEDV 强毒的病料，感染妊娠母猪，从而在母猪体内产生抗体，建立保护性免疫，并通过胎盘呈递给仔猪的同时保护仔猪。尽管此法较为普及，但在当时，由于使用强毒，也增大了仔猪发病的危险性。20世纪90 年代，国内外陆续开展了针对PEDV 和TGEV 的二联灭活苗、弱毒苗，甚至同猪轮状病毒结合的三联苗等的研究，并取得了巨大的成就。我国哈尔滨兽医研究所分别于1996 年和2004 年开发的TGE-PED 二联灭活苗、TGEPED 二联弱毒苗，都对我国当时乃至现在猪场在该病的防疫工作中提供了强有力的保障。与此同时，研究者对新的关于PEDV 的灭活苗和弱毒苗探索仍在不断进行，如牛小迎等[11]、邹勇等[12]都分别对PEDV、TGEV、PRV 三联灭活苗进行了免疫学研究，并发现他们均能在被免猪体内产生较强的保护性免疫。

此外，随着分子生物学技术的不断发展，随着基因工程疫苗概念的提出，国内外诸多学者，也不断地在分子水平上对PEDV 进行研究，主要针对于PEDV 的结构蛋白基因展开。如余丽芸等[13，14]就分别将PEDV 的E、M 等基因导入甲病毒载体启动子下游，并在其体外转录成5′末端含帽子结构的重组RNA。然后转染BHK21 细胞，收集病毒样粒子用于感染BHK21 细胞。采用细胞免疫化学的方法对转染和感染细胞的表达产物进行分析。研究发现pSFV-E RNA、pSFV-M RNA 转染和病毒粒子感染哺乳动物细胞表达的蛋白，可与抗PEDV 多克隆抗体起特异反应，证明体外转录的重组RNA 含有相应的特异序列产物，从而为进一步探讨以甲病毒载体为基础的病毒特异基因及其编码蛋白介导的抗病毒作用的研究奠定了基础；国内诸多学者也分别针对M、N 基因构建原核表达载体，从而研究其表达蛋白的免疫原性从而为以二基因作为基因工程疫苗候选基因提供了依据。高慎阳[15]将猪流行性腹泻病毒的 M 基因及编码M 蛋白膜外区M 基因片断（M′）分别亚克隆到原核表达载体pJLA605 和pGEX-6p-1 中，发 现只有N 端和C 端带有GST 的pGEX-6p-M-GST 和只含有膜外区M′基因的重组质粒pGEX-6p-M′获得了高效表达，其表达产物分别以融合蛋白GST-M 和GST-M′形式存在，为利用载体表达M 蛋白，从而研发亚单位疫苗，或直接利用M 基因研究基因工程疫苗，提供了参考；且在该研究中还发现，M 蛋白对宿主菌有一定毒性，也由于其对大肠杆菌的细胞壁进行破坏，推断出其与病毒的出芽功能有关。吕茂杰等则用pcD-NA3.1（＋）同N 基因构建重组质粒成功进行真核表达，结果表明N 蛋白具有免疫原性，且能在Vero 细胞中正确表达，为通过此基因研发PEDV 基因工程疫苗提供了参考。而目前在PEDV 的基因免疫原性中研究最多的是S 基因。如葛俊伟等[16]就利用PEDV S1 基因构建了重组干酪乳杆菌分泌性表达载体，并在干酪乳酸杆菌中获得表达，对蛋白免疫原性进行分析，结果表明该表达系统能刺激动物黏膜免疫应答和系统免疫应答，能诱导体液、细胞双重免疫应答，该研究为利用重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗奠定了基础。

5 亟待解决的问题

目前在PED 预防控制中有下列几个瓶颈问题，制约着防治工作。首先，缺失基层临床实际现地应用的商品化的快速、准确、方便的诊断方法。由于基层缺少可用的简单快速的诊断方法，现地的诊断大都是依据流行病学资料、临床症状、与解剖病理变化，由于非典型症状比较常见，常导致误诊。其二，中小型养殖户对腹泻病的重视程度不够，因而对其预防工作疏于管理。中小型养殖户当前眼里就那几个重要疾病，如蓝耳病、圆环病毒病、猪瘟、伪狂犬病等，很少对其他疫病进行免疫预防。其三，免疫接种密度不够，而大部分猪群处于免疫空白状态，迁居易感猪群的广泛存在，为腹泻病的流行提供了巨大潜在的因素。

6 预防与控制措施

目前PED 无有效药物治疗，需要加强饲养管理与预防控制，如加强对猪场的消毒综合防治措施，平时经常性的对圈舍卫生进行维护，对饲喂中使用的料槽、铲等器具及时消毒；加强对猪只的饲养管理，保持猪圈干燥、通风、保温；制定合理的免疫程序，采用TGEPED 二联灭活苗或二联弱毒苗进行群体免疫，并定期采集血清，应用ELISA法监测群体抗体水平。对已发病猪只进行隔离。治疗时以补液为主，饮水中加入黄芪多糖以提高免力，加入电解多维补充相应维生素，还应在饮水中加入一定浓度的钠盐和糖分。在治疗或预防该病时也可采用饲料添加抗生素，以防止或减少猪只由于病毒病感染和腹泻等消化系统症状造成的机体免疫水平下降，从而继发其他细菌性感染的可能。

在对该病的治疗中，有人提出采用“饥饿疗法”即每天补充糖盐水，但不给予饲料的方法。但也有学者认为该方法存在很大弊端，如在病重猪只消化道本来空虚的情况下，再不予以营养物质补给，导致其过剩的胃酸刺激或破坏肠黏膜，造成机体更大的损伤；在猪只被感染情况下，再不予以相应能量物质的补充，导致猪只消耗自体营养储备，加剧机体免疫水平下降[17]。故而当适量补充易消化、适口性好的饲料提供营养支持。

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