陈琳,黄红云

近年来,骨髓基质细胞、神经干/祖细胞、嗅鞘细胞、神经元等已应用于脑卒中临床治疗研究,初步结果令人振奋,本文就这方面的研究进展简述如下。

1 骨髓基质细胞(MSCs)

1.1 细胞制备、植入途径及联合其他疗法 Bang等取5 ml骨髓,用Ficoll密度离心法分离骨髓单个核细胞,1×106/ml接种于底部面积为175 cm2烧瓶,在低葡萄糖Dulbecco modified eagles'培养基中培养,其中含10%牛血清、1%青霉素/链霉素,孵育在恒湿37℃,5%CO2培养器内。5 d后更换培养液,去除非黏附细胞。黏附细胞在5～7 d内生长形成集落。当原代MSCs达到80%融合后,0.25%胰蛋白酶消化传代培养。每例患者的标本在23～37(30.8±5.5)d培养扩增到 1×108个细胞(按照体重参照,每只大鼠1×105～3×106)。临床使用前用胰蛋白酶消化,磷酸缓冲液洗涤,10 ml盐水重悬,生理盐水稀释到50～80 ml,在15～20 min内静脉输注。细胞量每次 5×107,发病后4～5周首次植入,7～9周第2次植入[1]。

邓志锋等抽取自体骨髓细胞悬液,在体外经过分离培养后,制成骨髓间充质干细胞悬液,通过静脉输注方式移植脑内:抽取自体骨髓悬液约80～100 ml,注入含肝素抗凝无菌玻璃瓶中,于无菌超净台离心,取自体血浆备用;骨髓细胞沉淀用等量的林格氏液稀释后加至淋巴细胞分离液上离心分离,吸取中间毛玻璃样的单核细胞层加至林格氏液离心洗涤3次,加约20 ml备用血浆和80 ml林格氏液稀释细胞,用吸管轻轻吹打,制成单细胞悬液分离出单个核细胞(可定向分化的干细胞)悬液。用带4号针头的注射器抽取细胞悬液,注入无菌输液袋中,将无菌输液袋在热合机下严密封口后,送至病房备移植用,同时取少许细胞悬液滴在血培养皿中做无菌实验。另外预留部分自体骨髓干细胞进行培养扩增,制备成细胞悬液用于再次进行自体骨髓干细胞移植。细胞移植前30 min,给予20%甘露醇125 ml快速静滴,增加血脑屏障通透性。细胞量为2×107～1.7×108,移植1～2次[2]。

1.2 疗效 Bang等进行了一项对培养扩增的自体MSCs治疗缺血性卒中患者前瞻性临床试验,试验共纳入30例伴有严重神经功能缺损的大脑中动脉梗死患者,随机分为2组。MSC治疗组(n=5)在发病1个月之后接受1×108个自体MSCs静脉输注;对照组(n=25)不接受MSC治疗。尽管MSC的数量巨大,而且这些细胞经过了体外扩增,但并未出现任何急性或迟发性毒性反应。在发病后1年内对两组患者的神经功能缺损评分和功能改善方面进行比较,每组对5例患者进行连续影像学检查。结果表明,与对照组相比,MSC治疗组患者转归明显较好,MSC组患者在随访期间的 Barthel指数(3、6和12个月时)和改良Rankin量表评分(3、6和12个月时)都有明显改善。M RI检查表明,MSC组包括梗死周围区在内的全脑萎缩明显减轻,这说明MSC能够扩散至整个脑组织中。连续评价表明,MSC治疗没有细胞治疗相关的、血清学或影像学上的不良反应[1]。

邓志锋等用自体骨髓基质细胞通过静脉移植治疗5例中枢神经系统损伤后神经功能障碍患者(脑卒中患者3例,脑外伤术后患者2例,最早7天,最长6个月)。移植治疗后所有患者均未见不良反应。出院0.5年后随访,最长随访时间达2年。5例患者神经功能缺损症状较移植前均有很大程度改善,其中2例神志不清患者神志恢复,可按吩咐动作;4例患者肌力提高1～3级;失语症状均得到一定改善[2]。

2 神经干/祖细胞

2.1 细胞制备、植入途径及联合其他疗法 杨清成等收集6～8周流产胚胎,取脑室区和室下区细胞,2.5 g/L胰蛋白酶消化,500～800 r/min离心4 min,DMEM-F12∶B27=50∶1加入。细胞悬浮培养(密度5×108)在 bFGF(20 μ g/L)培养基。在 37℃,500 ml/L CO2浓度培养5～6代。每次使用4×106个细胞,采用鞘内注射将细胞悬液注入蛛网膜下腔,通过脑脊液循环至大脑表面,个别病例通过引流管将细胞悬液注射到脑损伤处[3]。

张儒有等取孕12～14周流产胎儿的脑组织,彻底剥离脑组织表面的软脑膜和血管,将脑组织剪碎,120目铜网过滤后接种于75 cm 培养瓶,细 胞培养液为 含 30 μ g/L bFGF、20 μ g/L表皮生长因子、1%B27的DM EM/F12(1∶1)。细胞置于37℃、体积分数为0.05的CO2的培养箱中。体外连续培养和传代增殖。移植前将神经干细胞诱导成神经前体细胞。移植1次/周,共3次,通过腰椎穿刺蛛网膜下腔植入[4]。

卢旺盛等[5]取孕8～10周自然流产的胎儿(原文技术细节记录不详),采用立体定向技术,选取病灶侧脑软化区作为移植靶点,先在靶区注入地塞米松3 mg,然后用微量泵将3×107细胞(共0.3 ml)缓慢注入靶点。

2.2 疗效 杨清成等报道23例脑卒中患者,病程3个月～30年,以欧洲卒中量表评分标准(European stroke scale,ESS)提高1分以上为有效,结果中,19例有效,4例无效;移植后ESS评分、Barthel指数均提高[3]。随后又报道59例患者治疗结果,12例患者术后24 h内出现一过性发热,体温37.4℃～38.5℃,给予对症处理后体温渐降;6例患者术后感轻微头痛。24个月后随访,患者头颅CT、MRl、心电图、肺片及血液生化学指标均未发现异常;51例有效,8例无效;移植后ESS平均提高(2.7±2.5)分[6]。

张儒有等报道50例患者,末次发病至接受神经干细胞移植时间平均为3.4年,其中基底节病变39例,脑干病变3例,其他部位(丘脑、大脑半球)8例,累计多部位的病变6例。移植后6个月功能独立性评分(FIM)显著高于移植前[4]。

卢旺盛等[5]报道16例脑出血患者采用立体定向技术,选取病变侧基底节区作为靶点进行神经干细胞移植术,于治疗前、治疗后1个月、6个月进行神经功能评分和FIM。结果接受神经干细胞移植的脑出血患者无严重手术并发症。手术后6个月内临床症状改善有效率81.25%(13/16),FIM评分在6个月内持续升高。

3 嗅鞘细胞

3.1 细胞制备、植入途径及联合其他疗法 黄红云等取3～4个月流产胚胎嗅球,解剖镜下仔细剥离嗅球表面的软膜和血管组织,Hanks液冲洗2遍,剪成0.5～1 mm3大小,0.25%胰酶消化15 min,轻轻吹打使之形成细胞悬液;离心去除上清液(1200 r/min,5 min,室温)。稀释细胞浓度至106/ml,种植于无包被处理25 cm2培养瓶内,置CO2培养箱内培养(37℃)。细胞纯化采用Nash差速贴壁法结合阿糖胞苷抑制法,在培养24 h后轻轻吹打将细胞悬液吸出移入另一个无菌培养瓶,按106/ml接种到包被聚赖氨酸的24孔细胞培养板内培养。同时加入阿糖胞苷0.6 μ l/ml,48 h后80%换液。每 3 d换液 1次至14 d。每例定向微创手术移植2×106/100 μ l脑软化区周边或放射冠锥体束走行处(单靶点或2个靶点)[7-8]。

3.2 疗效 黄红云等报道7例患者,病程0.6～14.3年。缺血性卒中4例,出血性卒中3例。病变位于基底节和大脑半球6例,延髓1例。术后2周ADL评分增高,临床神经功能评分改善。症状改善主要包括语言、肢体肌力增加、高肌张力降低、平衡改善、疼痛减轻、呼吸改善。2例获得2年以上随访,1例43岁意大利籍女性,左基底核及额叶脑梗死3年接受细胞治疗。术后2年随访,患者言语较前流利,可说完整的句子;行走不再需要支具,步态基本正常;Barthel指数总分由70分增至90分,其中行走由0分增至15分,上下楼梯由 0分增至5分。另1例87岁中国籍女性患者,因脑梗死致记忆力下降1年,言语障碍、右侧肢体运动障碍6个月接受手术,2年随访,行走功能、反应能力和言语继续改善[9-10]。

4 人神经元细胞

Kondziolka等对12例患者伴有运动功能障碍基底节区卒中行神经元(human neuronal cells,hNT cells)脑内移植,年龄44～75岁,病史6个月～6年(至少功能稳定2个月)。随访12～18个月,未发现与细胞移植有关神经功能损害,6例患者ESS提高 3～10分,全部患者平均提高2.9分。6个月时,PET扫描有6例患者移植区糖代谢增加[11]。后他们又报道神经元细胞注射到26例患者的基底节卒中区或周边。手术当天早晨,细胞冷冻融化。使用专门设计的细胞植入套管,第1批患者植入2×106或6×106个细胞,通过 3或 9个点植入;第2批患者植入5×106或 1×107个细胞,通过25个点植入。植入时间2 h。除1例由于慢性硬膜下血肿行引流手术外,其他无手术并发症。最长随访5年,无细胞相关血清学和CT/MRI影像学异常改变,细胞保持活力[12]。还报道了9例脑卒中后2年以上的患者,其中2例为对照。神经细胞脑内移植6个月后评估,

4 例认知功能改善[13]。

Meltzer等对12例慢性基底节梗死并有运动障碍后遗症的患者在细胞移植前1周、移植后6和12个月行18F-脱氧葡萄糖正电子发射计算机断层扫描(FDG-PET)检查。结果显示,移植组卒中灶及其周围糖代谢活性有运动改善相关的提高[14]。Nelson等报道1例脑卒中患者脑内移植畸胎瘤细胞系(hNT)神经细胞,27个月后尸检发现仍有大量存活细胞(神经微丝免疫反应阳性神经元),荧光原位杂交检查显示无肿瘤形成[15]。

5 其他细胞

Rabinovich等经腰穿移植未成熟神经系统和血液系统细胞悬液治疗10例患者,手术后6个月所有治疗患者都有不同程度的神经功能改善,与对照组相比有显著性差异[16]。Savitz等[17]为5例脑卒中患者移植猪胚胎细胞,手术前对细胞进行免疫处理,患者没有服用免疫抑制剂,手术后1周,1例患者出现癫痫,1例患者出现运动障碍持续3周,其他患者没有不良反应;2例患者运动和语言改善,并持续超过4年。

[1]Bang OY,Lee JS,Lee PH,et al.Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients[J].Ann Neurol,2005,57(6):874-882.

[2]邓志锋,汪泱,邓丽影,等.自体骨髓间充质干细胞移植治疗中枢神经系统损伤性疾病(附五例报告)[J].实用临床医学,2007,8(6):62-65,70.

[3]杨清成,张向东,梁长春,等.脑卒中患者鞘内神经干细胞注射半年后功能状态评估[J].中国临床康复,2005,9(9):208-210.

[4]张儒有,郑永日,胡韶山,等.神经干细胞移植治疗脑卒中后遗症50例临床效果分析[J].中国临床康复,2006,10(9):138-139.

[5]卢旺盛,田增民,赵全军,等.立体定向神经干细胞移植治疗脑出血后遗症疗效分析[J].中华神经外科疾病研究杂志,2008,7(6):502-504.

[6]杨清成,梁长春,李敏霞,等.神经干细胞移植治疗脑卒中后遗症59例[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(20):4033-4035.

[7]黄红云,陈琳,郗海涛,等.嗅鞘细胞移植治疗中枢神经系统疾病1255例临床分析[J].中国修复重建外科杂志,2009,23(1):14-20.

[8]黄红云.嗅鞘细胞移植[M].北京:科学出版社,2007:254-262.

[9]黄红云.中枢神经修复学[M].北京:科学出版社,2009:304-306.

[10]刘瑞文,陈琳,黄红云,等.人胚胎嗅鞘细胞脑内移植治疗脑卒中后疼痛1例[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(25):4945-4947.

[11]Kondziolka D,Wechsler L,Goldstein S,et al.T ransplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke[J].Neurology,2000,55(4):565-569.

[12]Kondziolka D,Steinberg GK,Cullen SB,et al.Evaluation of surgical techniques for neuronal cell transplantation used in patients with stroke[J].Cell Transplant,2004,13(7-8):749-754.

[13]Stilley CS,Ryan CM,Kondziolka D,et al.Changes in cognitive function after neuronal cell transplantation for basal gang lia stroke[J].Neurology,2004,63(7):1320-1322.

[14]M eltzer CC,Kondziolka D,Villemagne VL,et al.Serial[18F]fluorodeoxyglucose positron emission tomog raphy after human neuronal implantation for stroke[J].Neurosurgery,2001,49(3):586-591.

[15]Nelson PT,Kondziolka D,Wechsler L,et al.Clonal human(hNT)neuron grafts for stroke therapy:neuropathology in a patient 27 months after implantation[J].Am J Pathol,2002,160(4):1201-1206.

[16]Rabinovich SS,Seledtsov VI,Banul NV,et al.Cell therapy of brain stroke[J].Bull Exp Biol Med,2005,139(1):126-128.

[17]Savitz SI,Dinsmo re J,Wu J,et al.Neurotransplantation of fetal porcine cells in patients with basal ganglia infarcts:a preliminary safety and feasibility study[J].Cerebrovasc Dis,2005,20(2):101-107.