张进隆

(甘肃畜牧工程职业技术学院,甘肃武威733006)

性别控制是奶牛生产中的重要研究课题之一。近年来,随着我国经济的飞速发展,人民生活水平的提高,对乳品需求量迅速地增加,但奶牛的饲养量远远不能满足人们对于乳品的需求,通过有效的方法控制奶牛的性别,增加母牛数量,显著提高优质奶牛繁殖效率,最大限度的发挥母牛的遗传能力及生产性能。对一个奶牛场来说,增加母牛的数量,不仅能有效提高奶牛的产母率,加快优质奶牛扩繁速度,而且可显著提升奶牛种群的整体质量。奶牛的性别控制主要从三个方面进行,即精子的有效分离、早期胚胎性别鉴定和受精环境的控制。

1 精子的流式细胞分离

通过有效的方法分离X、Y精子,选择X或 Y精子进行受精,在受精时就决定了奶牛性别。由于牛X精子DNA含量比Y精子高3.8%～4.4%、以精子DNA含量不同为依据的流式细胞分离技术是最有效的分离方法[1～3],流式细胞分离技术包括精液稀释,精液与荧光染料Hoeschst33342共同培养,染料渗入精子膜从而使DNA着色,由于着色量与DNA量成正比,因此X精子发出的荧光比Y精子强,放射出的荧光信号通过仪器和计算机系统扩增,当精子离开激光系统进入流动室时,计算机对已经识别的X、Y精子充上正电荷或负电荷,当带电液滴通过高压电场时,就会发生偏转,进入不同的收集管,达到分离X、Y精子的目的。1989年Johnson首次报道利用流式细胞仪成功分离兔活精子,并通过人工授精,获得相应性别的仔兔,雄性准确率81%,雌性准确率94%,并且在形态及生育能力上没有受到明显影响[1],之后通过技术上的不断改进,成功分离牛、羊等动物的精子,纯度达到了85%～95%。随着仪器的改进,分离的速度及精确度逐年提高,精子分离后的受精效果以及产生后代性别的准确性都有了明显提高,流式细胞仪的重分析是更为准确的方法。目前,性控精子已经在奶牛生产中,开始了大规模商业化推广,邰发红等[4]利用X性控冻精授配奶牛,母犊率达到94.9%,比对照组提高43.8%,取得了明显的效果。孙国庆[5]等研究了性控精液对奶牛情期受胎率及母犊率的影响,性控精液的母犊率(95.45%)极显著高于常规精液的母犊率(47.37%)(P<0.01),性控精液的流产率与犊牛成活率与常规精液差异不显著(P>0.05)。孙树春[6]等用经流式细胞分离仪分离的富含X精子的性控精液及常规精液对奶牛进行人工授精,性控精液与常规精液情期受胎率分别为54.81%(74/135)和 60.61%(40/66),两者之间差异不显著(P>0.05),试验组所产犊牛母犊率为97.14%(34/35),用性控精液进行人工授精所产后代的母犊率远远高于常规精液。赵国琳[7]等用X/Y种畜有限公司生产的奶牛性控冻精,共授配奶牛67头,怀孕45头,情期受胎率平均为67.16%;共产犊牛39头,其中母犊36头,公犊3头,死亡6头,母犊率达到 92.31%;对其中 20头犊牛出生时的体重、体尺进行了阶段性测定,与使用常规冻精所产母犊的生长发育指标进行比较,两者差异不显著(P>0.05)。

3 早期胚胎的性别鉴定

由于在Y染色体短臂上靠近常染色体区的35kb区域存在性别决定基因(SRY)。SRY/Sry是决定睾丸分化的候选基因,SRY基因为开放的读码框架结构,可编码204个氨基酸肽键,其中之一是能编码80多个保守氨基酸框架的睾丸决定因子(TDF)基因。SRY基因并不是决定性别的惟一基因,性别决定是以SRY基因为主导的多基因参与的有序协调过程。迄今为止,已发现包括SRY基因在内的 6 种 基因(SRY 、SOX9、MIS、WT-1、SF-1、DAX-1)参与了胚胎性别决定中从未分化原始生殖嵴开始到两性内生殖器官形成的全过程,因此,性别决定是一个多基因级联调控的过程,比一般的分化、发育更复杂。

胚胎性别鉴定是在胚胎的早期发育阶段,通过一定的实验方法鉴定胚胎的性别,选择相应的性别胚胎进行移植,来达到控制动物性别的目的,早期胚胎性别鉴定方法主要有细胞学方法、免疫学方法、分子生物学方法。PCR法因其特异性强、灵敏度高、快速、简便、经济等优点,利用雄性特异性基因探针和PCR扩增技术,是鉴别胚胎性别的崭新方法。在早期胚胎的性别鉴定中发挥着越来越重要的作用。1989年澳大利亚首先成功采用PCR技术在体外扩增牛的染色体特异DNA片段鉴别奶牛胚胎性别,准确率达90%以上,1995年欧阳红生[8]等用PCR技术对牛胚胎性别进行鉴定,准确率达100%。然后对PCR技术进行改进,利用多重PCR进行胚胎性别鉴定的准确率达95%以上,并可在24 h完成,由于该法灵敏度高,准确率达90%以上。应用两步PCR法进行性别鉴定,成功率达100%。黄淑帧[9]等应用巢式PCR技术对试管奶牛和试管山羊的胚胎DNA进行SRY基因的测定。以鉴定其性别,准确率100%。LAMP法是一种全新的基因扩增法,对目标基因的6个区段设定雄性特异性以及雌雄共同特异性引物,利用特殊的链置换型DNA聚合酶,在65℃的恒温条件下对胚细胞中的雄性特异性核酸序列和雌雄共有核酸序列进行扩增反应,最后通过反应过程中获得的副产物焦磷酸镁形成的白色沉淀的混浊度来进行早期胚胎的性别鉴定,约需要40 min,灵敏度很高。王海浪[10]利用此法对牛早期胚胎进行检测,其性别符合率达100%。黄金明[11]等利用睾丸特异蛋白基因(TSPY)建立了奶牛早期胚胎的非电泳性别鉴定方法,鉴定了 43枚胚胎的性别,对其中鉴定为雌性的21枚胚胎分别移植给自然发情后6～8 d的受体,结果9头出生的犊牛均为母牛。

4 环境因素和受精时间对性别的影响

性别控制也可以通过环境控制来实现,由于Y精子头小而圆,体积也小,在相同动力下比X精子运动快,但不耐受疲劳和酸,X精子则刚好相反,所以通过改变受精环境的PH值达到性别控制的目的。吴伟[12]等采用向母牛子宫颈内注人5%L型精氨酸,产母牛率分别63.8%,与48.8%的对照组相比,差异极显著。研究发现,在母牛排卵前授精易得雌性后代,在接近排卵时易得雄性后代,在受精当时预测的犊牛性别与实际产犊牛性别的符合率达到约70%,熊福建[13]等使用性别控制液后配种,母牛的产母犊率可以达到70%。奶牛的性别控制技术是一项复杂的生物技术,近年来,奶牛性别控制的方法已经取得了很大进展,目前性控精液在奶牛生产中逐步在推广应用,由于早期胚胎的性别鉴定推广应用受到一系列因素的限制,通过环境因素的影响获得的准确率相对较低,国产性控精液成年牛受胎率≥50%,产母牛犊率≥90%,所以是目前有效的奶牛性别控制方法。

[1]Johnson L A,Flook J P,Hawk H W.Sex preselection in rabbits:live births from X and Y sperm separated by DNA and cell sorting[J].Biology of Reproduction,1989,41:199-203.

[2]Johnson L A,Welch G R,Rens W.Beltsville sperm sexing technology:high-speed sperm sorting gives improved sperm output for in vitro fertilization and AI[J].J Animal Science,1999,77:213-220.

[3]Johnson L A.Sexing mammalian sperm for production of offspring:the state-of-art[J].Animal Reproduction Science,2000,60-61.

[4]邰发红,许国军,王新华.奶牛X性控冻精应用效果试验[J].中国奶牛,2009,(5):35-36.

[5]孙国庆,孙树春,赵驻军,等.性控精液对奶牛情期受胎率的影响[J].畜牧与兽医,2008,(11):59-60.

[6]孙树春,桑润滋,孙国庆.性控精液对奶牛人工授精情期受胎率及性比例的影响[J].黑龙江动物繁殖,2007,(1):6-8.

[7]赵国琳,魏立明,胡 刚,等.奶牛性控冻精应用效果研究[J].中国牛业科学,2009,35(01):17-18.

[8]欧阳红生,朴庆林.用PCR鉴别牛胚胎性别的研究[J].中国兽医学报,1995,(2):112-115.

[9]黄淑帧,陈美珏.试管牛和试管羊胚胎性别的鉴定[J].遗传,2000,(2):65-68.

[10]王海浪,薛建华,孙凤俊.简便快速的胚胎性别鉴定方法-LAMP法[J].黑龙江奶牛繁殖,2003,11(4):38-39.

[11]黄金明,王长法,李建斌,等.睾丸特异蛋白 Y基因(TSPY)对奶牛早期胚胎性别的鉴定[J].农业生物技术学报,2009,17(3):433-438.

[12]吴伟,刘润铮,王光辉,限制Y精子活力对犊牛性别的影响[J].吉林农业大学学报,1998,20(1):62-64.

[13]熊福建,铁树林,康淑英,等.性别控制液应用于母牛配种的试验报告[J].四川畜牧兽医,2005,(2):31.