石 骏

(四川省南溪县人民医院 644100)

本研究证明CD44和CD44v3在炎症性疾病PAD患者外周血单核细胞上有较高的表达,并且该高表达可以被鱼油下调。

1 临床资料

1.1 研究人群 研究方案包括了PAD患者和健康受试者,该研究获得了伦理委员会的同意,并给每位受试者签署了知情同意书。纳入患有症状性PAD(稳定的间歇性跛行)、踝臂压力指数小于0.9的男性患者和健康男性对照。排除了严重下肢缺血或在3个月前曾接受任何形式治疗的患者;排除患有任何部位动脉疾病或踝臂压力指数小于0.9的健康对照。健康对照均不能患有糖尿病、慢性炎症疾病,或正在接受免疫抑制治疗;被排除者还包括未受到良好控制的高血压患者(收缩压大于160 mm Hg,舒张压大于90mm H g),或在过去的5年内曾患有恶性疾病的患者,未服用鱼油胶囊或每周吃1条以上的鱼的患者。受试者在采血前2周内无感冒或轻度感染。

1.2 实验设计 试验开始时,所有患者和受试者在饥饿状态下采血以检测各项指标的基线水平,血样收集在 CPDA或EDTA抗凝的样品管中,并让血样在室温下凝集1 h。所有的受试者每天服用6×1 g的鱼油胶囊共12周,这样能够保证每天摄入1.02 g二十五碳五烯酸和0.69 g的二十二碳六烯酸。12周后第2次采集饥饿状态下的血样。

1.2.1 血浆三酰甘油和胆固醇的测量 采用标准色度法,检测血浆三酰甘油、总高密度脂蛋白胆固醇和总低密度脂蛋白胆固醇的浓度。

1.2.2 血液单核细胞分离 从CPDA保存的血样中分离单核细胞。采用6%的葡聚糖沉淀法除去红细胞,得到的富含白细胞的血浆在Nycoprep1.068上进行分层,并在室温下采用650 r/m in离心15m in,除去上层成分,含单核细胞的成分转移入新鲜的试管,然后用含0.3%的小牛血清清蛋白的PBS的洗涤。在6 m L的PBS-A中重新悬浮细胞,300 r/m in离心7m in以除去血小板。

1.2.3 流失细胞仪 对CPDA保存的全血样进行流式细胞分析。采用Serotec公司生产的结合藻红蛋白(PE)的抗CD14抗体和结合异硫氰酸荧光素(FITC)的抗CD54或抗CD44抗体进行标记。采用抗鼠的IgG1-FITC抗体和抗鼠的IgG2a-PE抗体作为同种型的对照抗体以明确背景色情况。黑暗状态下在饱和浓度的抗体培养液内培养细胞30 min,用PBS-A洗涤,在BD FACSCalibur流式细胞仪上采用Ce llquest软件进行分析。表达CD14的细胞被认为是单核细胞。采集单核细胞表面的CD44或CD54的中位荧光强度。

1.2.4 CD44v3测定 在平底96孔组织培养皿上培养单核细胞,培养基包括:0.75 mmoL的 L-谷氨酸、0.1 mg/m L的链霉素、0.1mg/m L的青霉素和5%的自体血清。每孔加入100 uL的培养基和3×104个细胞。部分培养的细胞接受10mg/m L的细菌内毒素的刺激。20 h后,采用500 g(重力常数)的离心力对培养皿进行离心,并将培养基换成冰块冷却的100 u L 2%甲醛,在4℃下固定细胞15m in。弃去甲醛,风干细胞,将培养皿用石蜡封口,-20℃储存备用。

解冻培养皿后,用含0.15%的 Tw een20(Sigma公司)的PBS液冲洗。1%的清蛋白阻断非特异性结合后,培养孔用PBS-Tw een液洗涤,再和 100μL 1μg/m L的鼠抗人CD44v3克隆或对照抗体共同孵育。用2%山羊血清阻断非特异性结合,100μL 0.5μg/m L的辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠多克隆抗体STAR77(Sigma公司)共同孵育。再用PBS-Tw een洗涤培养皿,邻苯二胺(Dako Cytomation)着色,100μL 1 mol/L的硫酸阻断反应。将培养皿在490 nm下,用Titretek+MS2平皿阅读器阅读。记录 2次光密度值(OD)的平均值,以CD44v3孔减去两个对照孔的平均值作为最后结果。

2 结 果

2.1 PAD患者和健康受试者的一般情况比较 48例PAD患者(年龄45～84岁)和 54例健康对照(年龄 46～84岁)被纳入研究。两组受试者的一般情况比较见表1。高密度脂蛋白胆固醇比率和血浆三酰甘油浓度这一指标两组之间差异无统计学意义,C反应蛋白的浓度PAD组高于对照组。

表1 PAD患者和健康对照组的一般情况比较

表1(续) PAD患者和健康对照组的一般情况比较

2.2 鱼油在调节PAD患者单核细胞CD44表达中的作用来源于PAD患者的单核细胞CD44的表达高于对照组,中位荧光强度分别为(480±27.8)OD和(336±25.1)OD(P＜0.05)。给予膳食补充鱼油12周后,PAD患者血单核细胞CD44的表达有所下降,中位荧光强度给药前为(480±27.8)OD,给药后为(427±26.2)OD(P＜0.05),但对照组患者的变化不明显,中位荧光强度给药前为(336±25.1)OD,给药后为(355±28.0)OD,图 1。

图1 两组外周血单核细胞的CD44表达在服用鱼油前后的变化(P＜0.05)

2.3 培养单核细胞CD44v3的表达 PAD患者来源的单核细胞CD44v3的表达低于健康对照者来源的单核细胞,PAD患者(0.15±0.15)OD,对照组(0.22±0.14)OD,P＜0.05。补充鱼油能够增加PAD患者来源的单核细胞的CD44v3的表达,给药前(0.15±0.15)OD,给药后(0.27±0.23)OD,P＜0.05。但是不能增加对照组来源的单核细胞CD44v3的表达,给药前(0.22±0.14)OD,给药后(0.17±0.1)OD,P＜0.05。

3 讨 论

本研究显示,PAD患者外周血单核细胞CD44表达量高于健康对照组。K rettek等[1]的Western blot检验结果表明血管粥样斑块中CD44的含量高于对照组,与本研究结果相似。本研究发现动脉粥样硬化患者外周血单核细胞CD44表达量较健康对照组高,且饮食中添加鱼油可降低动脉粥样硬化患者外周血单核细胞CD44的表达量,而对健康对照组无影响。

CD44与HA的结合对 HA的分解代谢起重要作用,而HA分解后产生的20 kDa亚单位可激活炎性细胞因子和基质金属蛋白酶,以及促进内皮细胞损伤[2]。鱼油饮食可降低某些炎性反应标志物的水平[3]。因此,鱼油饮食降低炎性反应的作用机制,很可能是降低外周血单核细胞CD 44表达量,从而降低HA的分解代谢。

根据鱼油饮食可降低血管疾病患者外周血单核细胞CD44表达量的研究结果,作者提出假设——鱼油饮食通过降低外周血单核细胞CD44的表达量,从而降低H A的分解代谢,减少HA分解所产生的炎症诱发因子,最终减弱泌物阻塞,在中叶开口周围分布有三组淋巴结,当受到炎症刺激后,局部的淋巴结变得肿大,压迫支气管从而导致管腔狭窄[3]。但据本组病例中在纤维支气管镜下所见,在右中叶管口除了有炎症改变之外,大部分未见管口狭窄引流不畅改变,绝大多数管腔是完整的。因此我们认为,右中叶肺不张发生率相对较高,右中叶不张可能与肺泡表面活性物质相对减少有关[4]。

3.3 纤维支气管镜检查及治疗 病因的检出率:本组76例老年肺不张患者,病因经纤维支气管镜检出率达92.1%。病因中肺癌占据首位,占总数的64.5%,故应积极进行检查,以便及早进行相关治疗。

纤维支气管镜检查及治疗:通过纤维支气管镜可直接窥见患者肺不张支气管内的形态变化。从镜检与病理结果的对比中可以发现,癌症肺不张通常病变多表现为结节、菜花样及息肉样,向管壁阻塞、浸润,多见于未分化癌[6];表面有坏死组织及水肿伪膜,活检质脆,容易出血者一般为鳞癌。支气管内膜结核表现为黏膜肥厚狭窄、糜烂溃疡、充血水肿、瘢痕狭窄,与邻近支气管黏膜无明显界限,有较广泛的浸润病变,有时呈多形性、多发性肉芽肿,肿块质软韧。炎症所致肺不张大部分为水肿、黏膜充血、脓性分泌物形成脓栓或堵塞。

通过纤维支气管镜可以对患者病变部位活检、刷检,可以明确病因。本组76例患者的诊断率为92.1%。通过纤维支气管镜检查不但可以对恶性病变得出明确的诊断结果,进而指导以后的治疗,对于良性病变,更可以通过纤维支气管镜吸净血块、分泌物等异物,促进患者的肺部复张。对于吸引出的分泌物进行细菌学培养,使得结果更为可靠,从而可以指导对患者进行相关的抗感染用药治疗。纤维支气管镜检查操作方便,只要术中注意监护,操作熟练轻巧,很少出现严重的并发症,本组中无1例出现气胸、喉痉挛、心搏呼吸骤停等严重并发症。因此,老年人肺不张经纤维支气管镜检查是一项有效、安全、必不可少的诊断手段。

综上所述,运用纤维支气管镜检查老年肺不张,是明确病因的一种非常重要的方法。应及早进行,及早确诊,为患者的治疗掌握先机。

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[2]刘淑华,陈志雄.肺不张的临床纤维支气管镜及病理检查特征分析[J].医师进修杂志,2004,27(11):31.

[3]郑逸华,毛娟华,王伟华.床边纤维支气管镜治疗肺不张47例分析[J].中国基层医药,2004,11(10):1224.

[4]侯长毅,赵淑娟,赵秉坤.67例肺不张纤维支气管镜检查分析[J].中国基层医药,2006,13(10):1728.

[5]段敏超,李家萱.纤维支气管镜检查肺不张86例临床分析[J].广西医科大学学报,2006,23(2):297.

[6]刘健,栾燕,胡小平,等.纤维支气管镜检查107例肺不张

病因分析[J].江西医药,2006,41(12):1029.