林锦骠 吴娟娟 王 利 邹 静 沈佰华 李宁丽

（上海交通大学医学院上海市免疫学研究所,上海 200025）

Cyr61促进RA滑膜细胞增殖及炎症因子调控研究①

林锦骠 吴娟娟 王 利②邹 静③沈佰华 李宁丽

（上海交通大学医学院上海市免疫学研究所,上海 200025）

目的:采用类风湿性关节炎（RA）患者滑膜细胞的体外培养,研究基质蛋白Cyr61在RA滑膜细胞增殖中的作用及其机制。方法:通过Real-time PCR、Westernblot和免疫组化检测RA病人的滑膜组织和细胞中Cyr61的表达情况;用3H-TdR掺入法检测滑膜液（SF）对滑膜细胞增殖的影响;用ELISA方法检测RA患者滑膜液中Cyr61蛋白的水平。结果:RA病人的滑膜组织和细胞中高表达Cyr61;SF能刺激滑膜细胞发生明显增殖;且RA患者滑膜液中含高浓度的Cyr61蛋白。用SiRNA干扰技术抑制滑膜细胞中Cyr61基因表达,再加入滑膜液后,则滑膜细胞增殖明显降低。同时,将SF与anti-Cyr61抗体共同孵育后再刺激滑膜细胞,FLS也不再发生明显增殖。进一步研究滑膜液中与上调Cyr61表达有关的炎症细胞因子,发现SF中IFN-γ和TNF-α具有上调Cyr61蛋白表达的作用。结论:Cyr61蛋白是促进滑膜细胞增殖的重要调控基因;RA患者滑膜液中含有高浓度的炎症因子IFN-γ和TNF-α,通过上调Cyr61蛋白表达而促进滑膜细胞增殖,可能是促进RA病理性滑膜增生的重要因素之一。

类风湿性关节炎;滑膜液,Cy r61;滑膜纤维样细胞;TNF-α/IFN-γ

Cyr61（Cysteine-rich 61）是一种分泌性基质蛋白,由381个氨基酸残基组成。最早于1985年被Lau等在用血清或血小板衍生生长因子（PDGF）刺激小鼠BALB/c 3T3成纤维细胞时所发现。因其结构中富含半胱氨酸（含10%的半胱氨酸残基）而被命名为富含半胱氨酸Cyr61（Cysteine-rich 61）。Cyr61具有明显的促有丝分裂活性和趋化性,可诱导成纤维细胞增殖和分泌细胞外基质,参与调节细胞增生、分化、胚胎发育形成,是生命活动的基本蛋白[1-4]。目前,对于Cyr61的研究多集中在肿瘤中,而在类风湿关节炎中的作用尚无报道[5-7]。

本文在采用表达芯片技术对4例RA病人的滑膜组织进行了表达基因表达谱的分析研究,发现Cyr61在RA患者的滑膜组织中显著升高的基础上,进一步采用RA滑膜细胞的体外培养、增殖实验、基因敲除技术等,较为系统地研究了Cyr61在RA滑膜细胞增殖中的作用,结果发现:RA滑液中含有较高浓度的Cyr61蛋白,具有介导RA滑膜细胞增殖的作用。而RA滑液中的炎症因子TNF-α和IFN-γ能够上调Cyr61表达,这可能是导致RA病理性滑膜增殖的重要因素之一。这一研究为今后发现治疗RA新靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 病人标本 20例RA患者滑膜组织来自于上海光华中西医结合医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的RA病人。所有病例的诊断符合1987年美国风湿病协会（ARA）修订的类风湿关节炎分类标准[8]。其中女性 18例,男性 2例,年龄 40～60岁,病程平均（12±6）年。20例OA患者滑膜组织来自于上海光华中西医结合医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的OA病人。所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准[9]。其中女性13例,男性7例,年龄40～60岁,病程平均（22±8）年。2例正常滑膜组织来自于本校第九人民医院骨科,为外伤手术病人关节滑膜组织。上述患者滑膜组织用于体外培养（详见下述）,部分组织用4%多聚甲醛固定后留作免疫组化,血清和滑膜液（SF）高速离心后取上清,-80℃储存待用。本研究中所用临床样本,均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。

1.2 滑膜细胞体外培养 将无菌获取的滑膜组织用PBS清洗后,用无菌手术剪刀反复剪切成约1mm×1mm×1mm的组织块,加入胶原酶Ⅱ（0.5mg/m l）,37℃、消化2小时后,经 200目纱网过滤,离心去上清后,将细胞重悬于DMEM培养液,置于37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。当细胞长成梭形并成片后,进行传代培养。当细胞传至第3代后,分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD19和PE 标记的小鼠抗人CD11b进行标记,流式细胞仪检测鉴定。上述4种标记均为阴性的细胞为成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like Synoviocytes,FLS）用于本研究。

1.3 Cyr61表达检测

1.3.1 Real-time PCR检测Cyr61表达 采用ABI公司提供的软件prism2.0设计所检测基因表达引物,序列见表1。Real-time PCR操作与结果分析同以前报道[10]。简述之:收集滑膜组织与FLS,用Trazol提取RNA,经随机引物逆转录为cDNA后,将荧光染料SYBRGreen和目的基因Cyr61与内参GADPH的引物混匀后,加入 Real-time PCR检测板、密封、上机检测（ABI 7900）。所采用的反应条件为:50℃2分钟,95℃10分钟,95℃15秒,60℃60秒,共 40个循环。根据PCR反应信号强度Ct值计算每个样本的Cyr61基因相对表达量。

表1 Real-time PCR检测基因及引物序列Tab.1 Gene and primer sequence for Real-time PCR

1.3.2 免疫组织化学检测滑膜组织Cyr61表达将所获取的滑膜组织用4%多聚甲醛固定,经脱水、包埋、切片固定等常规方法获得滑膜组织切片。经常规二甲苯脱腊、梯度酒精脱苯、洗涤后进行Cyr61免疫组化染色。简述之:首先用兔血清封闭切片的非特异性抗原、去血清后加1∶50的羊抗人Cyr61多克隆抗体（Sant Cruz,USA）及抗人IgG作为空白对照,4℃过夜后,洗涤、加生物素标记的兔抗羊IgG,室温20分钟后加辣根过氧化物酶标记的链霉素亲和素标记抗体,经DAB缓冲液显色,中止后用苏木素复染,常规脱水,透明封片。显微镜下拍照（×40）,并采用图像分析法对免疫组化结果进行相对定量分析。

1.3.3 Western blot检测FLS细胞Cyr61蛋白表达常规Western blot方法检测FLS中Cyr61表达。

1.4 ELISA方法检测滑膜液中Cyr61蛋白 采用自制的鼠抗人Cyr61单克隆抗体（将另文报道）包被ELISA板,其余同常规ELISA方法。简述之:鼠抗人Cyr61单克隆抗体包被（1μg/孔）并于4℃过夜,次日用1%BSA-PBS封闭2小时,加入RA患者滑膜液及骨关节炎患者滑膜液各30份及RA患者血清20份,

100μl/孔。同时加入倍比稀释的hCyr61标准蛋白（200、100、50、25、12.5、6.25、3.13、0 ng/ml）。经37℃孵育1小时后,加入市售羊抗人Cyr61抗体（Sant Cruz,USA）100μl/孔,孵育后加辣根过氧化物酶标记的兔抗羊IgG抗体工作液、OPD底物显色、终止反应后于酶标仪上测定OD（492 nm）值,根据hCyr61标准蛋白测定的OD值制作标准曲线,获得待测样品中Cyr61蛋白浓度。

1.5 成纤维样滑膜细胞增殖实验和抗体中和实验将 FLS接种于 96孔细胞培养板中,每孔2×103cells/孔/200μl。37℃、5%CO2培养箱孵育 12小时后,加入不同稀释度的RA滑膜液,继续孵育24小时,加入3H-TdR（1μCi/孔）,再培养 18小时,收集细胞,加液体闪烁液,β计数仪检测cpm值。抗体中和实验:FLS接种至96孔培养板中,将抗人Cyr61单抗按照 1∶25、1∶50、1∶100 比例加入 SF 中混匀 ,同时设无关单抗（1∶25）为对照。经与滑膜细胞培养24小时后加3H-TdR（1μCi/孔）,再培养18小时,收集细胞,加液体闪烁液,β计数仪检测cpm值以观察FLS的增殖作用变化。

1.6 Cyr61 SiRNA干扰实验 根据GeneBank数据,人工合成随机SiRNA（上海吉玛制药技术有限公司）3对。采用Real-time PCR对于所合成的SiRNA干扰效果进行筛选。选用干扰效果达70%的SiRNA进行Cyr61干扰实验。简述之:在5×104FLS中加入转染试剂（Lipofectin 2000,USA）与对照 SiRNA（称SiNC）和 Cyr61特异性 SiRNA（SiCyr61）,混匀后,37℃、5%CO2培养,24～48小时后,取被干扰细胞进行Cyr61相对表达量检测,检测干扰效果和对于滑膜细胞增殖的影响（滑膜细胞增殖测定方法同上）。

1.7 细胞因子刺激和抗体中和实验 将重组人IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α加入培养的 FLS中 ,8小时后Real-time PCR检测Cyr61的mRNA表达水平。所用细胞因子浓度为:IL-10 0.1 ng/ml,IL-12 0.5 ng/ml,IFN-γ0.05 ng/ml,TNF-α0.05 ng/ml,滑膜液（1∶5 稀释）作为阳性对照。细胞因子抗体阻断实验:将抗IFN-γ（10 μg/m l）和抗 TNF-α（200 ng/ml）分别与IFN-γ、TNF-α、滑膜液混匀后加入滑膜细胞共同孵育,8小时后检测Cyr61的mRNA表达水平。

1.8 统计学分析 采用Grafpphad prism 5.0进行作图和分析。实验数据以±s表示,组间比较采用t检验,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RA患者滑膜组织中Cyr61表达增高 本实验室前期运用基因芯片检测发现Cyr61基因在RA滑膜组织中表达远远高于正常人和骨关节炎（OA）患者滑膜组织（图1A）,为明确RA病人FLS中Cyr61的表达情况,我们应用Real-time PCR分析了10例RA患者外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞及滑膜组织中Cyr61mRNA的表达水平。结果可见:RA患者的滑膜组织Cyr61基因的相对含量比RA患者的外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞以及正常人的外周血单个核细胞分别高8.7倍、125倍及13.3倍（P＜0.05）,证实了基因芯片的结果。进一步用免疫组化染色的方法观察了Cyr61在滑膜组织不同细胞中的分布及蛋白表达水平。结果发现:与OA及正常滑膜组织相比,RA患者滑膜衬里层和衬里下层巨噬细胞样滑膜细胞浸润,血管增生,大量淋巴细胞,浆细胞和单核细胞浸润,淋巴滤泡形成伴纤维素样坏死,FLS增生,而OA与正常人滑膜组织仅少量Cyr61表达（图1C）。采用图像分析证实了这一结果（图1D）。

图1 RA患者组织及细胞中Cyr61基因的相对含量表达格局Fig.1 Relativeexpression of Cyr61 in synovial tissues and cells of RA patients

图2 体外培养的RA FLS中高表达Cyr61Fig.2 Overexpression of Cyr61 in RA FLS in vitro

2.2 RA病人滑膜成纤维细胞Cyr61表达增高 为深入研究RA患者滑膜细胞中Cyr61表达与作用机理,我们在体外培养了滑膜细胞（FLS）并用Real-time PCR分析了FLS中Cyr61mRNA的表达格局。结果可见:在RA患者的FLS中Cyr61基因的相对含量明显高于滑膜组织（图2A）,说明Cyr61主要在RA滑膜组织的成纤维样滑膜细胞中表达增高;同时我们还比较了RA、OA和正常人培养至第3代的FLS中Cyr61mRNA的表达水平。如图2B所示,在RA患者的FLS中Cyr61基因的相对表达量比OA患者和正常人的FLS分别高3.5倍、20倍,从mRNA水平上证实了Cyr61在 RA病人 FLS表达增高。进一步用Western blot的方法对RA、OA和正常人的FLS进行Cyr61蛋白表达水平检测。结果表明 RA FLS中Cyr61表达水平明显高于OA和正常人FLS,从而验证免疫组化的结果,更加证明Cyr61主要表达在滑膜的成纤维样细胞中（图2C）。

2.3 RA的滑膜液（SF）刺激FLS增殖与Cyr61表达为了观察局部炎症环境对于FLS的生物学效应和Cyr61表达的影响,我们将RA患者的滑膜液（SF）加入培养的细胞中,采用Real-time PCR和Western blot观察滑膜液对FLS中Cyr61mRNA和蛋白表达的影响。结果表明:RA滑膜液能够促进FLS中Cyr61mRNA和蛋白表达（图3A）。进一步采用3H-TdR掺入法,观察不同浓度滑液对于RA-FLS增殖的影响。结果表明:与对照组相比,各剂量组滑膜液均能促进RA FLS增殖并呈剂量依赖性（图3B）。

图3 不同浓度滑膜液对于FLS Cyr61表达和增殖的影响Fig.3 Enhancement of FLSexp ression of Cyr61 and proliferation by synovial fluid

图4 RA滑液中Cyr61含量与抗Cyr61抗体阻断实验Fig.4 Concentration of Cyr61 in RA SF and anti-Cyr61 neutralization assay

2.4 RA患者SF中Cyr61浓度增高,抗Cyr61抗体能够阻断SF促进FLS增殖 由于Cyr61是一种分泌性蛋白,具有明显的促有丝分裂活性,可诱导成纤维细胞增殖。而我们的实验也证实RA病人滑膜细胞中高表达Cyr61蛋白,为此我们采用本室制备的鼠抗人Cyr61单抗检测RA SF（n=30）中Cyr61蛋白的含量,并与OA SF和RA患者外周血清相对比。结果显示:RA SF中Cyr61蛋白明显高于对照OA SF,RA患者外周血（图 4A）。而进一步采用抗人Cyr61单抗进行中和实验,结果发现:Cyr61单克隆抗体能够中和RA-SF刺激滑膜细胞增殖的作用,并且呈剂量依赖性。当RA-SF稀释到1∶100,阻断作用基本消失（图4B）。表明Cyr61蛋白具有刺激滑膜细胞增殖作用。

图5 Cyr61特异性基因干扰实验图Fig.5 Specific Cyr61 SiRNA in RA FLS

图6 IFN-γ和TNF-α均可上调RA FLS中 Cyr61的表达Fig.6 Elevated expression of Cyr61 by IFN-γand TNF-αin RA FLS

2.5 特异性基因干扰实验验证Cyr61具有促进FLS增殖作用 我们分别设计了3条针对人Cyr61基因的双链小RNA（SiRNA）,同时用与哺乳动物无关的SiRNA作为阴性对照（SiRNA of Negative control,siNC）。用脂质体（Lipofectin2000）将SiRNA转染到细胞中,光学显微镜图和荧光显微镜观察表明转染率达80%～90%。用Real-time PCR检测干扰24小时后Cyr61的表达水平,其中H-3是针对人Cyr61的特异性SiRNA,抑制率约为 70%～80%（图5A）,因此,选用这一SiRNA进行FLS增殖实验。进一步观察了干扰的最佳时间,发现干扰24小时效果最好（图5B）。因此,采用干扰24小时,结果表明当FLS中Cyr61表达受到干扰时,FLS受到滑液刺激后的增殖明显降低（图5C）,提示Cyr61是介导SF刺激后滑膜细胞增殖的重要基因。

2.6 RASF中 IFN-γ和TNF-α可上调Cyr61表达由于SF中含有高浓度的细胞因子[11],为了明确这些细胞因子是否与Cyr61上调有关,本研究中用纯化的细胞因子分别刺激RA FLS,观察其Cyr61的表达情况。为了模拟其在体内的作用,细胞因子的浓度选择为在SF中能够检测到的浓度。结果表明:IFN-γ和TNF-α能够上调Cyr61的表达（图 6A）。为了明确该两种细胞因子的作用,进而采用阻断抗体anti-IFN-γ（10μg/ml）和 anti-TNF-α（200 ng/ml）分别与SF混匀,在刺激8小时后收集培养的细胞,使用Real-time PCR的方法检测其Cyr61的表达水平。结果显示:用IFN-γ和TNF-α抗体阻断后,SF的刺激作用也明显下降,联合阻断的作用更明显（图6B）。

3 讨论

类风湿性关节炎（Rheumatoida athritis,RA）是一种以滑膜组织炎性增生、关节进行性破坏为特征的慢性炎症性自身免疫性疾病。其病因尚不明确,最近研究发现,除了细胞因子和Th1/Th2细胞失衡外,非T细胞成分如FLS（Fibroblast-like synoviocytes,FLS）具有转化细胞的特性,RA异常增生的滑膜组织类似于局限性侵袭生长的肿瘤,造成关节的破坏[12-15]。有研究报道,滑膜组织增生与癌基因和凋亡相关基因具有相关性,但Cyr61在RA滑膜组织增生中的作用,尚未见报道。

本实验室前期运用表达基因芯片检测发现Cyr61基因在RA滑膜组织中表达增高。为进一步验证此结果,我们应用Real-time PCR分析了RA患者外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞,以及完整滑膜组织中Cyr61的表达水平,结果发现,RA患者的滑膜组织Cyr61基因的相对含量高于患者的外周血、关节液和滑膜组织来源的单个核细胞以及正常人的外周血单个核细胞。证实了用表达芯片所获得结果。而用免疫组化也证实了只有RA滑膜组织高表达Cyr61,蛋白表达主要存在于滑膜衬里层细胞及衬里下层血管内皮细胞、FLS。而OA患者和正常人的滑膜组织细胞中Cyr61表达比较微弱,并只分布在滑膜衬里层细胞中。

为了深入研究Cyr61在RA滑膜组织中高表达的病理意义,我们首先建立了RA滑膜细胞的体外原代培养,并获得纯化（原代培养第3代后）的纤维样滑膜细胞（FLS）。在基因和蛋白水平上与OA和正常人滑膜组织的FLS进行比较,明确了RA FLS中Cyr61的表达明显高于OA和正常人FLS。在此基础上,我们研究了Cyr61表达与关节滑膜液、FLS增殖及与炎症因子的关系。

我们首先用不同浓度的滑膜液刺激体外培养的滑膜细胞,发现RA的SF能上调FLS中Cyr61表达,同时促进FLS增殖,而且Cyr61表达和FLS增殖均与滑液加入量呈正相关,即表现出典型的剂量依赖性。由于RA FLS中高表达Cyr61蛋白,而Cyr61又是一种分泌蛋白,因此我们推测RA SF中可能存在Cyr61蛋白,这一推测通过ELISA检测了RA和OA SF中Cyr61的含量得到证实:RA SF中Cyr61蛋白含量明显高于对照OA SF和RA患者外周血。而将抗Cyr61单克隆抗体加入SF,用于中和Cyr61作用,结果显示这种处理后,SF刺激FLS增殖的能力明显下降,说明Cyr61的确能够增强SF刺激FLS增殖的作用。

RNA干扰（RNA interference,RNAi）是近几年才发现的一种生物学现象,它由长21～23个碱基对的双链RNA介导,通过碱基互补配对,导致序列特异的基因沉默。目前,RNA干扰已被广泛应用于探索基因功能、防治病毒感染以及治疗肿瘤[16-18]。小干扰RNA（Small interfering RNA,SiRNA）抑制效率高,可达90%以上,而且没有明显的毒副作用。因此是近年应用最为广泛的特异性基因功能研究方法。我们针对Cyr61mRNA三个不同位点设计了三组SiRNA,并通过干扰后Cyr61表达变化筛选出干扰效率最高的Cyr61特异性SiRNA。用这一SiRNA转染FLS,干扰FLS中Cyr61基因表达,发现SiRNA干扰后,再用SF刺激,FLS增殖明显下降,证实了Cyr61的确是介导FLS增殖的关键基因。

由于RA SF中含有多种高浓度的细胞因子为RA滑膜炎提供了重要的微环境,在RA的发生和发展起重要作用[19,20]。我们推测SF中含有某些炎性细胞因子可能参与了Cyr61表达的上调。为了验证这一想法,我们用纯化的细胞因子IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α分别刺激FLS,结果发现只有IFN-γ和TNF-α能够上调FLS中Cyr61表达。进一步采取抗IFN-γ和抗TNF-α中和抗体分别或同时与SF预孵育,以达到中和 SF中TNF-α和 IFN-γ的目的,然后再用这种预处理的SF刺激FLS,结果显示此时的SF刺激FLS增殖的作用明显下降。提示:RA SF含有的高浓度TNF-α和IFN-γ能够通过上调滑膜细胞中Cyr61表达,继而,Cyr61促进滑膜细胞增生。

关于滑膜组织增生与癌基因和凋亡相关基因的关系已有研究报道[21-23],但是Cyr61与RA滑膜细胞增殖则未见报道。本研究首次报道了Cyr61蛋白介导RA滑膜增殖,而SF中的炎症因子TNF-α和IFN-γ能够上调Cyr61表达。这可能是导致RA病理性滑膜增殖的重要因素之一。这为今后进一步筛选治疗RA新靶点提供实验依据。但是,关于Cyr61如何促进滑膜细胞增殖及其调控机制尚待进一步研究。

1 KunzM,Moeller S,Koczan Detal.Mechanismsof hypoxic gene regulation of angiogenesis factor Cyr61 in melanoma cells[J].J Biol Chem,2003;278（46）:45651-45660.

2 Xie D,Yin D,Wang H Jetal.Levelsof expression ofCYR61 and CTGF are prognostic for tumor progression and survival of individuals with gliomas[J].Clin Cancer Res,2004;10（6）:2072-2081.

3 Tong X,O'Kelly J,Xie Detal.Cyr61 suppresses the growth of nonsmall-cell lung cancer cellsvia the beta-catenin-c-myc-p53 pathway[J].Oncogene,2004;23（28）:4847-4855.

4 Grzeszkiewicz TM,Kirschling D J,Chen Netal.CYR61 stimulateshuman skin fibroblastm igration through Integrin alphavbeta5 and enhances mitogenesis through integrin alpha vbeta3,independentof its carboxyl-terminaldomain[J].JBiolChem,2001;276（24）:21943-21950.

5 Chen N,Chen CC,Lau L F.Adhesion of human skin fibroblasts toCyr61 ismediated through integrin alpha6beta1 and cellsurface heparan sulfate proteoglycans[J].JBiol Chem,2000;275（32）:24953-24961.

6 Holloway S E,Beck AW,Girard Letal.Increased expression of Cyr61（CCN1）identified in peritonealmetastases from human pancreatic cancer[J].JAm CollSurg,2005;200（3）:371-377.

7 Sampath D,Zhu Y,Winneker R Cetal.Aberrant expression of Cyr61,a member of the CCN（CTGF/Cyr61/Cef10/NOVH）family,and dysregulation by 17 beta-estradioland basic fibroblastgrowth factor in human uterine leiomyomas[J].JClin EndocrinolMetab,2001;86（4）:1707-1715.

8 Arnett F C,Edworthy SM,Bloch D Aetal.The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,1988;31（3）:315-324.

9 A ltman R,Asch E,Bloch Detal.Development of criteria for the c lassification and reporting of osteoarthritis.Classification of osteoarthritis of the knee.Diagnostic and therapeutic criteria committee of the American Rheumatism Association[J].A rthritis Rheum,1986;29（8）:1039-1049.

10 Du F,Wang L,Zhang Yetal.Role ofGADD45 beta in the regulation of synovial fluid T cellapoptosis in rheumatoid arthritis[J].Clin Immunol,2008;128（2）:238-247.

11 Miossec P.An update on the cytokine network in rheumatoid arthritis[J].CurrOpin Rheumatol,2004;16（3）:218-222.

12 Harris ED Jr.Rheumatoid arthritis.Pathophysiology and implications for therapy[J].N Engl JMed,1990;322（18）:1277-1289.

13 Bromley M,Woolley D E.Histopathology of the rheumatoid lesion.Identification of cell types at sitesof cartilage erosion[J].A rthritis Rheum,1984;27（8）:857-863.

14 TrabandtA,AicherW K,Gay REetal.Expression of the collagenolytic and Ras-induced cysteineproteinase cathepsin L and proliferation-associated oncogenes in synovial cells of MRL/I mice and patients with rheumatoid arthritis[J].Matrix,1990;10（6）:349-361.

15 Muller-Ladner U,K riegsmann J,Franklin BNetal.Synovial fibroblasts of patientswith rheumatoid arthritis attach to and invade normal human cartilagewhen engrafted into SCID m ice[J].Am J Pathol,1996;149（5）:1607-1615.

16 Tuschl T.Expanding small RNA interference[J].Nat Biotechnol,2002;20（5）:446-448.

17 Yu JY,DeRuiter S L,Turner D L.RNA interference by expression of short-interfering RNAsand hairpin RNAs in mammalian cells[J].Proc Natl Acad SciUSA,2002;99（9）:6047-6052.

18 SchwarzDS,Hutvagner G,Du Tetal.Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex[J].Cell,2003;115（2）:199-208.

19 Ciurtin C,Cojocaru VM,Miron IMetal.Correlation between different componentsof synovial fluid and pathogenesisof rheumatic diseases[J].Rom J Intern Med,2006;44（2）:171-181.

20 Wan B,Nie H,Liu Aetal.Aberrant regulation of synovialT cellactivation by soluble costimulatorymolecules in rheumatoid arthritis[J].J Immunol,2006;177（12）:8844-8850.

21 Nakashima M,Eguchi K,Aoyagi Tetal.Expression of basic fibroblast growth factor in synovial tissues from patientswith rheumatoid arthritis:detection by immunohistological staining and in situ hybridisation[J].Ann Rheum Dis,1994;53（1）:45-50.

22 Sano H,Engleka K,Mathern Petal.Coexpression of phosphotyrosinecontaining proteins,platelet-derived growth factor-B,and fibroblast growth factor-1 in situ in synovial tissues of patients with rheumatoid arthritisand Lewis ratswith adjuvant or streptococcal cellwall arthritis[J].JClin Invest,1993;91（2）:553-565.

23 Shiozawa S,Shiozawa K,Tanaka Yetal.Human epidermal growth factor for the stratification of synovial lining layer and neovascularisation in rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis,1989;48（10）:820-828.

[收稿2009-11-08]

（编辑 张晓舟）

Cyr61 promotes proliferation of fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis and its regulation by inflammatory factor

LINJin-Piao,WUJuan-Juan,WANGLi,ZOUJing,SHENBai-Hua,LINing-Li.ShanghaiInstituteofImmunology,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200025,China

Objective:To investigate the effectof Cyr61 on the proliferation of Fibroblast-like Synoviocytes（FLS）in rheumatoid arthritis（RA）.Methods:Cyr61 expression in synovial tissues（ST）and FLSwas examined using Real-time PCR,Westernb lot and immunohistochemistry simultaneously.FLSwere isolated from synovial tissueof RA patients and cultured in vitro.The proliferation of FLSstimulated with synovial fluid（SF）was determined by3H-TdR incorporation.Cyr61 protein level in RA SF was detected by ELISA.Results:Cyr61 was over expressed in ST,FLSof RA patientswhilehardly examined in normal individuals and osterarthritis（OA）patients.Meanwhile,Cy r61 protein level was elevated in SF,which promoted the proliferation of RA FLS.This proliferation was abrogated by knockdown the Cyr61 gene of FLS or neutralizingmonoclonal antibody againsthuman Cyr61.Moreover,inflammatory factor IFN-γand TNF-αup-regulated the expressionof Cyr61.Conclusion:These results indicate that the elevated level of IFN-γand TNF-αin RA SF can promote the proliferation of the FLS derived from RA patients by increasing expression of Cyr61,suggesting that Cyr61may play an important role in the development of RA.

Rheumatoid arthritis;Synovium fu lid,Cyr61;Fibroblast-like synoviocytes;TNF-α/IFN-γ

R392

A

1000-484X（2010）03-0264-06

①本文受国家自然基金（30872990）、863项目（2008AA02Z429）、上海市科委（08JC1413200）、上海市教委（J50207）、仁济医院基础医学院合作研究基金项目（PY07011）资助

②上海交通大学医学院免疫学教研室,上海200025

③上海交通大学医学院附属仁济医院呼吸科,上海200025

林锦骠（1985年-）,男,在读硕士,主要从事自身免疫与免疫调节研究,E-mail:jinpiaolin@yahoo.com.cn;

及指导教师:李宁丽（1957年-）,女,博士,教授,主要从事自身免疫与免疫调节研究,E-mail:ninglixiaoxue57@yahoo.com.cn。