周进康， 何 军， 梁志远， 冉晓燕

(贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州贵阳550018)

青阳参(Cynanchum otophyllum Scheid)为萝摩科鹅绒藤属植物，又名青羊参、白石参、断节参等。主要分布于云南、贵州等西南山区。青阳参有效成分是从其根部提取的甾体皂苷类物质，有益肾强筋、豁痰镇痉、定痫之功效，用于治疗癫痫、腰骨痛、头昏头痛等症［1，2］。青阳参总皂苷(total saponins)的药理作用［3，4］、化学成分［5-6］等的研究得到人们关注。但是，关于青阳参皂苷提取方法研究报道少见。我们以青阳参皂苷提取率为指标，采用微波法提取，对微波提取工艺进行了考察，并与回流法、索氏提取法进行比较，发现微波法简便易行，效率较高。

1 材料

1.1 仪器

722S可见光分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，XH-100A微波催化合成/萃取仪(北京祥鸽科技有限公司);RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);Sarforius电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2 试剂

青阳参药材(云南千草源药业有限公司)，青阳参皂苷对照品(批号:20070460，纯度99.9%，云南白药集团天然药物研究院)，甲醇、无水乙醇、冰醋酸、高氯酸、香草醛等均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 青阳参皂苷对照品溶液的制备 精密称取青阳参皂苷对照品19.6 mg，置500 mL量瓶中。用甲醇定容至刻度，摇匀，即为0.039 2 mg/mL的青阳参皂苷对照液。

2.1.2 青阳参皂苷供试液的制备 精密吸取各种提取工艺得到的提取液1 mL至50 mL量瓶中，甲醇定容至刻度即为供试液。

2.2 青阳参总皂苷比色方法的建立

2.2.1 青阳参皂苷的显色 精密吸取对照液(或供试液)于试管中蒸干。加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液-高氯酸(1∶4)1 mL，在60℃水浴中加热15 min后取出，冰水浴冷却后加5 mL甲醇，摇匀待测。

2.2.2 测定波长的确定 取对照液2 mL，用上述方法显色，另取5%香草醛冰醋酸溶液-高氯酸(1︰4)1 mL，在60℃水浴中加热15 min，冰水浴冷却后加5 mL甲醇，摇匀为空白对照，在300～650 nm波长处扫描，结果显示，最大吸收波长选578 nm较合适。取供试液，同法操作，显示最大吸收波长为578 nm，见图1。

图1 青阳参提取液光谱图

结果表明对照液和供试液合适的最大吸收波长一致，选定578 nm作为测定波长。

2.2.3 显色稳定性考察 取2 mL对照液和供试液分别于试管中蒸干，用上述方法显色，按2.2.2项测试方法在578 nm处测定吸光度值(测定完立即放入冰水中)，每小时测定一次，测5次。结果578 nm处吸光度值的RSD分别为1.2%和1.4%，表明样品在冰水中放置稳定性较好。

2.2.4 标准曲线的绘制 精密吸取青阳参皂苷对照液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，挥去溶剂，用上述显色和测试方法于波长578 nm处测定吸光度A。以对照液皂苷浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。求得回归方程:A=6.172 7C+0.030 6，r=0.999 9，n=5。线性范围:0.039 2～0.196 0 mg/mL。

2.2.5 样品的测定 精密吸取供试液2 mL，用上述显色和测试方法，于578 nm处测定吸光度A。由回归方程得皂苷浓度C，由下式计算青阳参总皂苷的提取率(W为青阳参生药干粉的质量)。

2.3 提取工艺

2.3.1 醇浓度的考察 精密称取约5 g青阳参生药干粉6份，置于100 mL烧瓶中，分别加入30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇水溶液50 mL，微波辐射(80 W)处理15 min。取出冷却即得提取液，加溶剂重复提取1次，合并提取液，过滤，浓缩并定容至100 mL，按2.1.2项配成得供试液，用上述显色和测试方法，测定其吸光度，计算青阳参总皂苷的浓度和提取率，每个样品平行两份，结果取均值。发现当乙醇浓度为60%时提取率达到稳定，结果见表1。

表1 乙醇浓度对提取率的影响

2.3.2 投料比的确定 精密称取约5 g青阳参生药干粉5份，置于 100 mL 烧瓶中，分别加入 25、40、50、60、75 mL 60%乙醇水溶液，微波(80 W)辐射15 min。取出冰水冷却后，得提取液，加溶剂重复提取1次，合并提液，过滤，浓缩并定容至100 mL，按2.1.2项配成得供试液。用上述显色和测试方法，测定其吸光度，计算青阳参总皂苷的浓度和提取率，每个样品平行两份，结果取均值。从结果发现当料液比增至1∶10时提取率基本稳定，结果见表2。

表2 投料比对提取率的影响

2.3.3 微波条件的选择 精密称取约5 g青阳参生药干粉9份，于100 mL烧瓶中，正交试验优化青阳参皂苷的提取工艺条件，即以提取微波功率、温度、时间、提取次数作研究对象，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平见表3。合并提取液，过滤，浓缩，定容至100 mL得提取液，按2.1.2项配成得供试液，用上述显色和测试方法，测定其吸光度，计算青阳参总皂苷的浓度和提取率，结果见表4。

表3 因素水平表

表4 L9(34)正交试验结果

2.3.4 工艺验证 取约5 g青阳参生药干粉4份，按工艺参数A2B3C2D2提取，合并两次提取的提取液，过滤，浓缩，定容至100 mL，按2.1.2项配成得供试液，用上述显色和测试方法，测定其吸光度，计算青阳参总皂苷的浓度和提取率。青阳参皂苷的提取率平均达到3.21%以上，结果见表5。

2.3.5 微波法与回流、索氏提取法的比较 按上述正交实验确定的微波法提取工艺，在溶剂乙醇浓度、料液比等条件相同的条件下，进行微波、回流、索氏法提取，分别进行4次平行试验，提取参数和提取率差异见表6。

3 讨论

3.1 由正交实验(表3、4)进行极差分析，结果表明，各因素的影响力由大到小依次是:微波功率、温度、次数、时间，即A2>B3>D2>C3。由于15 min和20 min对提取率影响无太大差异，考虑到节约时间和能源，可选用15 min进行提取，因此最佳的提取工艺组合为:A2B3C2D2。结合表1、2的结果，即确定工艺条件为功率80 W、温度60℃、时间15 min、次数2、乙醇浓度60%、液料比1∶10。

表5 工艺验证结果

表6 微波和回流、索氏方法的比较

3.2 微波法用于青阳参总皂苷的提取，工艺验证结果较好，提取重复性高(表5)。应用微波技术［7］:物料吸收微波后，通过偶极子旋转和离子传导两种方式由内外同时加热，温度升高较快。同时，从表6结果可看出，微波法和回流法、索氏提取法相比，提取率变化不大，却可有效降低提取所需的温度和时间，降低了能耗，能快速且方便地进行青阳参皂苷的提取。但由于微波仪器容积的限制，目前仅用于科学研究和含量的测定。

3.3 青阳参的主要活性成分为甾体皂苷类物质。随着青阳参药理作用的研究和认识［2-4］，青阳参将会得到进一步的开发和应用，它的提取工艺也将被人们所关注。

［1］孙跃农，闫继兰.民族药青阳参的临床运用［J］，中国民族民间医药杂志，1999，40:309.

［2］杜忠德，高学广.青阳参片辅助治疗癫痫30例临床分析［J］，中华临床医药，2004，5(16):116.

［3］裴印权，曹龙光.青羊参的中枢药理作用研究［J］，北京医学院学报，1981 ，3(13):213-218.

［4］李建一，赵天睿，南国华.青羊参对小鼠脑中几种氨基酸含量的影响［J］，中国药理学通报，1987，3(3):144-147.

［5］Zhao Yibin，Shen Yuemao，He Hongping.A new C21steroidal glycoside from cynanchum otophyllum［J］.Acta Botanica Yunnan，2005，27(4):443-446.

［6］杨庆雄.人工栽培青阳参化学成分及抗抑郁活性研究［J］.贵州科学，2007，25:421-426.

［7］李作平，张嫂丽，詹文红.微波萃取技术在中药有效成分提取中的应用［J］.时珍国医国药，2001，15(1):55-57.