蒋海强 聂 磊 李运伦

(1.山东中医药大学教学实验中心，济南 250335; 2.山东大学药学院，济南 250011；3.山东中医药大学附属医院高血压中医临床研究基地，济南 250011)

代谢组学的原理和技术是研究中医证侯本质的重要技术平台[1]，能够从代谢网络终端表象的整体角度反映生物体的功能水平[2]，揭示生物体的病理生理变化实质和机制[3，4]，而高效液相色谱(HPLC)分析是代谢组学研究中采用的技术之一，适合分离代谢产物中的复杂成分而后进行检测。为了研究高血压病肝阳上亢证患者和健康志愿者血清成分图谱的差异，寻找可能的生物标记物,揭示高血压病肝阳上亢的证候本质，笔者采用高效液相色谱结合主成分分析(PCA)方法，对高血压病肝阳上亢证患者和健康志愿者的血液成分谱进行了分析和模式识别。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，配有四元泵，DAD 检测器，自动进样器，美国Agilent 公司；

电喷雾离子阱型质谱仪：Agilent 6300型，美国Agilent 公司，

电子天平：FA1104 型，上海精天电子仪器厂；

甲醇：美国 Tedia公司；

冰乙酸：美国 Tedia公司；

实验用水为娃哈哈纯净水;

实验对象：根据《1999 WHO/ISH高血压治疗指南》的高血压诊断标准[5]和中医肝阳上亢证的辩证标准[6]，选择知情同意、志愿受试、经过2周“洗脱期”后舒张压在90～109 mmHg的2级高血压病肝阳上亢证患者10例，同时选择健康志愿者12例，两组在年龄、性别分布方面无差异(P<0.05)。

1.2 实验方法

(1)血清样品预处理

清晨取空腹静脉血，抗凝，取抗凝处理的血浆样品适量,以4 000 r/min离心10 min。取上清液，精密移取300 μL，加入600 μL的甲醇，混匀器混匀10 min，然后于4℃，以14 000 r/min，高速离心10 min。取上清液，用0.45 μm滤膜过滤，制得供试样品，低温冰箱保存。

(2)色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，美国安捷伦公司;流动相：0.2%冰乙酸-甲醇，流速为1.0 mL/min；检测波长： 254 nm；进样量：20 μL；色谱图采集时间不少于73 min；洗脱梯度见表1。

表1 洗脱梯度

(3)质谱条件

采用电喷雾离子源，正离子模式检测；雾化气压力：103.4 kPa(15 psi)；干燥气流量：5 L/min；干燥温度：325℃；毛细管电压：3 000 V；质量扫描范围：50～1 000m/z。

2 结果与讨论

2.1 代谢指纹图谱方法学考察

(1)空白溶剂考察

取供试品制备所用甲醇，按照梯度洗脱条件进样，试验结果表明试剂无干扰。

(2)精密度、重复性和稳定性试验

取同一供试品溶液(高血压病肝阳上亢证患者)，重复进样6次进行分析，考察仪器的精密度；取同一患者血浆，分别制样6份，进行色谱分析，考察方法的重复性；取同一供试品溶液(高血压病肝阳上亢证患者)，分别放置0、1、2、4、8、12、24 h后，进行色谱分析，考察样品的稳定性。将所得数据采用国家药典委员会编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件进行处理，结果表明，其相似度均高于0.9。

2.2 高血压病肝阳上亢证HPLC色谱指纹图谱的建立

分别取高血压病肝阳上亢证病人和健康志愿者的血浆，按照1.2所述方法制备供试品溶液，然后注入高效液相色谱仪，记录色谱图，建立高血压病肝阳上亢证病人血清指纹图谱，10个高血压病肝阳上亢证病人血清样品的色谱图见图1。

图1 高血压病肝阳上亢证病人血清高效液相色谱指纹图谱

2.3 主成分分析

对色谱图进行积分获得各色谱峰保留时间、峰面积的信息，色谱数据输出得到AIA格式的文件，导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，对齐、匹配各色谱峰，输出excel格式数据文件，匹配的数据进行了百分比归一的正规化处理，以消除血清浓度对样本分类的影响。首先采用t-test对色谱峰进行逐个检验，结果发现在70个色谱峰中有3个色谱峰在两类间具有显著性差异(α=0.05)。基于这3个特征峰，构成20×3矩阵，导入Matlab软件，进行行主成分分析，其PCA得分图如图2所示。两个主成分得分分别是PC1：60.545 6%和PC2:29.376 1%，二者之和大于85%，符合主成分分析变量得分的要求，除了1和4号患者样本混于健康志愿组中，其余样本已基本分开。

图2 基于3个特征峰高血压病样本与正常样本的PCA得分图

为探讨由t-test选取的特征峰对两类样本划分的贡献，根据t-test选取的特征峰，构成20×3矩阵，作相应的负载图(图3)，探讨3个成分对高血压病肝阳上亢组和健康志愿组分类的影响，离图的中心越远，对分类的影响越大。由图3可知，3个峰中峰3对两组分类的影响最大，峰1和峰2次之，峰3、峰1和峰2对应的特征峰(RT分别为15.520、14.484、15.096 min)对划分两类样本具有重要的贡献，因此可以利用相应的质谱图对这些起重要作用的色谱特征峰进行解析，以探究其物质基础。

图3 主成分负载图

2.4 特征峰质谱分析

保留时间15.520、14.484、15.096 min特征峰所对应质谱图m/z列于表2。

表2 特征峰的保留时间及m/z

血清样品的高效液相色谱PCA结果表明，高血压组和健康志愿者组在积分值散点图中呈聚类分布，两组基本分开。对PC1和PC2进一步分析发现，与空白组相比，高血压病肝阳上亢证患者体内代谢成分有明显差异。由于本实验所用离子阱质谱为低分辨型质谱，未能确定化合物的分子式及结构，需经高分辨质谱检测后方可确定其化学结构。

3 结论

采用高效液相色谱和主成分分析的方法研究高血压病肝阳上亢证，对高血压病肝阳上亢病人和健康志愿者血清样品进行分析和模式识别，同时进行了标记物寻找，经质谱测定，基本能确定其分子量。结果显示，尽管在高血压病肝阳上亢病人和无症状高血压病患者各自组内，血清成分存在个体差异，在一定程度上造成了两组样本的交叉，但从PCA的得分图可以看出，两组样本基本能够分开，且类别清晰、明确。

该项工作有利于深入认识和理解高血压病肝阳上亢证的本质，同时为该类疾病的临床诊断和治疗研究提供依据。血清代谢组学分析能够较好地反映高血压病肝阳上亢证的代谢特征，高效液相色谱质谱联用技术结合模式识别的代谢组学方法可用于研

究复杂条件下机体病理生理状态变化，揭示中医症候本质。

[1] 李运伦.代谢组学是研究证候实质和方剂原理的重要技术平台[J].山东中医药大学学报，2008，32(3)：187-189.

[2] Nicholson J K, Lindon J C, Holmes E. Metabonomics：Understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuliviamultivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data[J]. Xenobiotica,1999,29:1 181-1 189.

[3] 周明眉,刘平,贾伟,等.基于代谢网络变化的中药整体效应评价方法研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2006,8:113-119.

[4] 贾伟,蒋健,刘平,等.代谢组学在中医药复杂理论体系研究中的应用[J].中国中药杂志,2006,31:621-624.

[5] 林金秀，吴可贵.1999年WHO/ISH关于高血压治疗指南[J].高血压杂志，1999，7(2)：97

[6] 郑筱萸.中药新药临床研究指导原则(试行)[M].北京:中国医药科技出版社,2002:73-76.