熊富良，靳文运，何广华，张雪琼，万志敏

(武汉理工大学化工学院，湖北武汉430070)

黄连素临床上常用于肠道感染、菌痢等疾病的治疗。但黄连素味极苦，口服吸收差［1］。将黄连素制成肠控释制剂，可以减少给药量，提高疗效，降低不良反应发生率。

郭锋蜂等用滴入发制备海藻酸/大豆分离蛋白复合微球包裹盐酸小檗碱［2］;孙红武等制备了黄连素口服纳米乳［1］;郑玲利等将盐酸黄连素制成具有生物黏附性的pH敏感包衣片;汪丽芬等制备盐酸黄连素肠溶微囊［3］。

海藻酸钠是一种阴离子聚电解质多糖，利用二价阳离子交联其羧基可形成凝胶微球。本实验用海藻酸钠为原料，制备海藻酸钙凝胶小球，用浸渍法载入黄连素，不但提高了载药量，而且制备方法简便，具有良好缓控释效果，有很好的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

UV1101型紫外分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司);SHZ-82气浴恒温振荡器(国华企业);85-2恒温磁力搅拌器(国华电器有限公司);79-2理化烘干箱(上海漏电保护厂);Nicolet-1705X傅立叶变换红外光谱仪( Thermo Nicolit公司);D2F-6050真空干燥箱(上海博迅实业有限公司)。

黄连素购买于方晟生物开发有限公司;海藻酸钠购买于中国医药集团化学试剂有限公司;无水氯化钙(分析纯)购买于上海泗联化工厂有限公司;氢氧化钠(分析纯)购买于天津市博迪化工有限公司;磷酸二氢钾(分析纯)国药集团化工试剂有限公司;盐酸(分析纯)武汉华松精细化工。

1.2 试验方法

1.2.1 负载黄连素的海藻酸钙胶小球的制备配制一定浓度的海藻酸钠溶液，滴入一定浓度的氯化钙溶液中，交联一段时间，取出，用去离子水洗涤至无氯离子，得到空白凝胶小球，将该凝胶小球加入黄连素溶液中恒温振荡，取出载药凝胶小球，用去离子水洗掉表面吸附的黄连素，平铺在表面皿上用电风扇吹干后，在真空干燥箱里干燥至恒重。

1.2.2 黄连素含量测定工作曲线的绘制检测波长的确定将黄连素及空白海藻酸钙凝胶小球分别用pH 7.4磷酸盐缓冲液溶解，超声滤过，取续滤液在200～500 nm波长范围内进行紫外扫描。黄连素在344 nm、262 nm、227 nm处有吸收峰，而空白海藻酸钙微球的紫外扫描344 nm处几乎没有吸收，故确定344 nm为检测波长。精密称取干燥至恒重的黄连素10 mg置于100 mL量瓶，pH 7.4磷酸盐缓冲液溶解并定容，精密吸取此溶液适量，配制浓度为0.002、0.004、0.006、0.008、0.01 mg/mL的系列标准溶液，于344 nm波长处测定吸收度。吸收度A对浓度C进行线性回归，得标准曲线方程如下:A=68.829×C－0.007 5，r=0.999 4。结果表明，在344 nm处，黄连素浓度C在2～10 μg/mL范围内与吸光度A线性相关。

含量测定方法精密吸取5mL释药瓶中的溶液于50 mL量瓶中，以pH 7.4磷酸盐缓冲液定容，于344 nm波长处测定吸光度，代入相应标准曲线求算黄连素含量。

1.2.3 溶胀性能测试称取一定质量(记作m0)经真空干燥的空白凝胶小球，分别置于pH 1.0盐酸溶液及pH 7.4的磷酸缓冲液中，分别对应人体内胃、肠环境的pH值。每隔一定的时间(t)取出试样，经网筛脱去溶液后，用滤纸吸取表面的溶液，然后称重得到溶胀后的质量(记作mt)。溶胀度S的计算参照以下公式:

1.2.4 载药量测定将黄连素累积释放的最大质量除以所称取的干燥海藻酸钠水凝胶的质量即得，公式为:

其中:W0－黄连素累积释放的最大质量值;M0－干燥海藻酸钙凝胶载药小球的质量。

1.2.5 载药凝胶小球体外释放实验精密称取80 mg制备好的样品，用玻璃纸(内有5 mL pH1.0缓冲溶液)密封好，放入100 mL pH1.0的缓冲溶液里，37℃恒温振荡2 h，取5 mL试液装入50 mL量瓶中。把装有载药小球的玻璃纸转入100 mL pH7.4的缓冲溶液里，37℃恒温振荡，间隔1，2，3，6 h取样，每次取5 mL试液，补加5 mL pH7.4的缓冲溶液，试液放入50 mL的量瓶。用pH7.4的缓冲溶液稀释取得的样液至50 mL，紫外测吸光度。

释药率根据标准曲线计算取样时刻黄连素的累计释放质量和最后累积释放的最大值，根据下式:

其中:Wx－按吸光度计算得到x时刻的黄连素累积质量;W0－黄连素累积释放的最大质量值。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

图1表明载药凝胶小球在1 510 cm－1处的吸收峰属于苯环骨架振动，证明黄连素进入凝胶小球内部。

图1 海藻酸钠、海藻酸钙和载药凝胶小球的红外光谱图

2.2 空白凝胶小球的溶胀行为

图2为未载药小球在pH 1.0的盐酸溶液以及pH 7.4的磷酸缓冲液中的溶胀性能。海藻酸分子上—COOH的pH敏感性，小球的溶胀度在不同pH条件下具有很大的差别。小球在pH 1.0下几乎不溶胀，在pH 7.4溶液中，海藻酸钙凝胶小球与碱性介质接触后，表面溶胀形成透明的凝胶层，凝胶层的外侧存在一个溶蚀前沿(凝胶与释放介质的界面)，在凝胶层的内侧存在一个溶胀前沿，碱性介质中，小球中药物的释放是通过凝胶层的扩散和溶蚀双重机制实现的，其中起主要作用的是溶蚀。

图2 2%海藻酸钠+2%CaCl2凝胶的溶胀性

2.3 各种因素对载药小球体外释放的影响

2.3.1 凝胶小球载药量比较见表1。结果表明，载药量最大可以达到16.03%。但是用1%的海藻酸钠制备水凝胶时，由于溶液浓度过低，成球性不好，干燥时容易黏在一起，且易变形。所以选择较大浓度的2%的海藻酸钠制空白水凝胶，避免以上缺陷。交联时间对载药量影响不大。黄连素浓度越高载药量越大，选择0.15%为最佳浓度。

表1 不同条件制备载药凝胶小球的载药量

2.3.2 不同交联时间对凝胶小球释药性能的影响

图3可以看出，随着交联时间的增加，载药凝胶小球的释药速率减慢，这是因为交联时间越长，凝胶溶胀越慢，黄连素是通过凝胶的溶胀来释放的。此外，交联70 min和交联120 min的释药曲线比较接近，这是因为随着交联时间的增加，凝胶的性能逐渐接近，直至交联完全，凝胶的性能将不在改变。而由预实验可知，交联2、4、8 h，凝胶小球的性能是不变的，所以，120 min是比较理想的交联时间。

图3 不同交联时间的黄连素凝胶小球在pH7.4的缓冲溶液中的释药率曲线

2.3.3 黄连素的浓度对凝胶小球释药性能的影响

图4可以看出，各试品前两个小时的药物释放率很接近，随时间增加，在高浓度的黄连素中浸泡的凝胶小球的释放率会显著的提高，特别是在0.15%的黄连素中浸泡的，其释药率大大的高于其余试品组。

药物从凝胶小球中释放，依靠的是凝胶外层的溶蚀释放以及药物因浓度的差异向外的扩散。载药量大的，外层溶蚀释放的越多，同时药物通过凝胶层的扩散越快。但不同载药量导致单个凝胶小球的质量是有很大差异，称取相同质量的小球，载药量小的个数最多，载药量大的个数最少，小球个数的不同，释放面积也就不同，在没有别的因素影响时，释放面积大的释放快，释放面积小的释放慢。在开始释药时，由于溶蚀处于凝胶小球的外层，影响相对较小，载药量小的释放会稍微快点，随着时间的增加，溶蚀向小球内部推进，它的影响将越来越大，载药量大的小球的释药率也逐步增加，直到最后小球全部溶蚀，它的影响将达到最大，这时载药量大的释放率将远远大于载药量小的。

图4 不同黄连素浸泡液浓度凝胶小球在pH7.4的缓冲溶液中的释药率曲线

2.3.4 海藻酸钠浓度对凝胶小球释药性能的影响

图5可以看出，释放速率随着海藻酸钠浓度的增加而加快。

图5 不同海藻酸钠浓度黄连素凝胶小球在pH7.4的缓冲溶液中的释药率曲线

在制备凝胶小球的过程中，可以观察到，3种凝胶小球的致密性不一样，3%海藻酸钠制备的凝胶小球最致密，1%海藻酸钠制备的相对疏松，由于致密性的不同，在浸泡时药物进入空白凝胶小球的难易有差异。显然，药物更容易进入比较疏松的小球，更容易深入该小球的内部。对于致密性高的小球，药物更倾向于集中在小球外层，而内层相对较少。因此，小球由外向内溶蚀时，致密性高的小球的释药速率会高于致密性低的小球。

2.4 释药机制的考察

将黄连素海藻酸钙缓释凝胶小球进行体外释放度试验，将不同时间点药物累积释放百分率进行拟合，结果见表2。

表2 药物累积释放百分率的回归结果

表2可得，Higuchi方程模型明显优于零级方程模型，释放度和时间有良好的相关性。对于圆球形制剂释药曲线拟合的Higuchi方程的n值在0.03～0.05之间，推测Non-Fickian扩散控制药物释放，即药物扩散和骨架溶蚀的协同作用，实际观察发现，缓释凝胶小球释放4 h后骨架基本溶蚀，同时结合Higuchi方程拟合线性关系良好，可见骨架的溶蚀机制起主导作用。

3 结论

黄连素海藻酸钙缓释凝胶小球在0.1 mol/L的HCl中2 h内虽然未溶胀，但与H+作用在膜表面生成部分亲水性海藻酸，引起膜有限膨胀，骨架松驰，药物通过聚合物骨架中的孔隙扩散到介质中，故前期药物释放主要是通过微丸的孔道和膜扩散，释放量很少。换成pH 7.4PBS后微丸开始溶胀，海藻酸钙凝胶小球与缓冲液中的离子(Na+，K+)作用生成水溶性海藻酸盐，则小球发生溶蚀，此时药物释放以通过骨架溶蚀为主，扩散为辅，体外释放行为符合non-Fickian扩散释放机制。通过对优化的工艺，可以制备成球形好，载药量高的黄连素海藻酸钙缓释凝胶小球，该凝胶小球在模拟胃的pH 1.0条件下，累积释放量被控制在10%以下，可减小黄连素对胃部的刺激。同时，黄连素在肠部分更易于释放的特点，可用于溃疡性结肠炎的治疗。

［1］孙红武，欧阳五庆.黄连素口服纳米乳的研制、质量及安全性评价［J］.上海交通大学学报(农业科学版)，2007，25(1):61-65.

［2］许沛虎，郭锋蜂，黄进，等.盐酸小檗碱经海藻酸/大豆蛋白复合微球负载后的释放行为［J］.武汉大学学报(理学版)，2008，54(2):134-138.

［3］汪丽芬，陈亚军，刘卫，等.盐酸黄连素肠溶微囊的制备及评价［J］.中国医院药学杂志，2008，28(4):312-314.