魏 玲， 李苏宜， 曹苏生

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，对其预后文献报道不一，总的5年生存率为20%左右[1]。Bmi-1是多梳基因(PcG)家族成员，首次被提出是在1991年，Haupt等[2]发现在转基因鼠的淋巴瘤细胞传代中，其作为一种原癌基因与另一种癌基因C-myc协同作用可引起细胞转化和肿瘤形成。bmi-1基因与肿瘤形成、预后的关系在国内外正在逐步受到重视。但是，关于Bmi-1在食管癌组织中的表达研究，目前仅有国外的少量报道。本研究旨在通过免疫组化染色的方法，检测Bmi-1在食管鳞癌组织中的表达，以探讨其与食管鳞癌临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集徐州市中心医院2002年至2008年保存的食管癌石蜡标本30例，所有病例均经病理学确诊为食管鳞癌。其中男性24例，女性6例，中位年龄59岁。根据TNM分期法,临床分期为Ⅰ、Ⅱ期的病例18例,Ⅲ期的病例12例；30例中有16例发生淋巴结转移,14例无淋巴结转移。所有组织标本均经10%甲醛固定,石蜡包埋。

1.2 试剂与方法 每个蜡块取4 μm厚连续切片做免疫组化染色。鼠抗人Bmi-1单克隆抗体购自英国Abcam公司,抗体稀释液和二步法免疫组化检测试剂盒购自北京中杉公司。

用免疫组化方法检测食管鳞癌组织中Bmi-1的表达。先将切片置于二甲苯中脱蜡,乙醇梯度水化处理, 柠檬酸缓冲液抗原煮沸修复,滴加鼠抗人Bmi-1(1∶50, 英国Abcam公司)，37℃孵育 1 h，滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体,DAB显色,苏木精复染,盐酸乙醇固定,封片,观察。用PBS代替一抗做阴性对照。

1.3 结果判断 光学显微镜下观察组织标本的着色程度。Bmi-1蛋白阳性表达主要表现为细胞核内呈现棕黄色或者棕褐色颗粒。高倍镜下(放大400倍)随机取4个不同的视野,计数细胞总数及核阳性细胞数,按阳性细胞所占的百分比计分:阳性细胞率≤10%为1分,阳性细胞率>10%而≤50%为2分,阳性细胞率>50%而≤75%为3分,阳性细胞率>75%为4分。同时,根据染色的强弱程度计分:阴性染色1分,弱染色2分,中等强度染色3分,强染色4分。根据二者的乘积判断结果:≤4分为(-)，>4分而≤8分为(+)，>8分而≤12分为(++)，>12分而≤16分为(+++)。统计分析时(-)和(+)合计为阴性表达,(++)和(+++)合计为阳性表达。以上结果均至少由两位病理科医生以双盲法观察确定。

1.4 统计学分析 用SPSS 13.0统计软件对实验数据用R×C表Fisher′s Exact Test 进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Bmi-1在食管鳞癌组织中的表达 Bmi-1的阳性表达主要为细胞核内出现棕黄色颗粒(见图1)。30例食管鳞癌标本中Bmi-1的阳性率为26.6%(8/30), 食管癌旁组织标本中Bmi-1的阳性率为6.6%(2/30),可见 Bmi-1在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.05)。

图1 Bmi-1在食管癌组织中的阳性表达

2.2 Bmi-1在食管鳞癌组织中的表达与临床病理特征的关系 Bmi-1蛋白高表达与食管鳞癌TNM分期、浸润深度密切相关,即Bmi-1蛋白在侵及肌层的食管鳞癌中的表达明显低于在肿瘤侵及外膜的食管鳞癌中表达; TNM分期中Ⅲ期的患者Bmi-1蛋白表达高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05),但与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无关 (P>0.05)。(见表1)

表1 Bmi-1的表达与食管鳞癌临床病理特征的关系

3 讨论

人类bmi-1基因位于第10号染色体短臂13区(10p13)， Bmi-1蛋白与果蝇Psc和Su(z)2蛋白结构相似，其氨基端为环指结构域(ring finger domain，RF)，中间部分为螺旋-转角-螺旋-转角-螺旋-转角(H-T-H-T-H-T)结构，是DNA结合域，正是这两个区域与细胞转录及肿瘤形成有关[2]。Bmi-1是一种广泛表达的核蛋白, 参与干细胞的自我更新和维持，在肿瘤的发生发展过程中，高表达的Bmi-l被认为是肿瘤中存在的肿瘤干细胞。Dirks[3]报道，Bmi-1低表达的肿瘤细胞有较低的侵袭性，因为他有较少的干细胞。最近一些研究[4]显示Bmi-1 高表达时负性调控 p16INK4a 蛋白表达, 使 p16INK4a 蛋白表达下调，促进细胞周期进入 S 期，从而促使细胞的生长和增殖； Bmi-1 高表达还抑制 p19ARF，阻止细胞周期停滞和细胞凋亡，导致细胞增殖。Bmi-1直接参与肿瘤的发生发展和浸润转移。Bmi-1在血液系统恶性肿瘤及肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌等多种肿瘤中表达异常。Song等[5]研究证实Bmi-1在胰腺癌细胞株和胰腺癌组织中起正调节作用，Bmi-1高表达与淋巴结转移有关，Bmi-1阳性表达者生存率低。Li等[6]研究发现Bmi-1蛋白过度表达与结肠癌的淋巴结转移、临床分期、远端转移密切相关，Bmi-1阳性者的5年生存率明显低于 Bmi-1阴性者，在多因素分析中 Bmi-1是影响生存率的因素，其表达上调是结肠癌患者预后不良的标志。对146例原发胃癌患者进行的研究发现[7], 免疫组化结果显示有99例表达了Bmi-1, Bmi-1的过表达程度与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移有高度相关性, 通过RT-PCR证明胃癌组织中Bmi-1的翻译和转录水平均上调。作者认为, Bmi-1可成为胃癌的诊断和独立预后指标之一。日本兵库医学院Fujiwara等[8]的研究表明,对于食管鳞状细胞癌患者,干细胞标志物Bmi-1表达阳性与新辅助放化疗后早期复发及预后不良相关, Bmi-1阳性提示食管癌预后不佳。

本实验结果表明，Bmi-1在食管鳞癌旁组织中的表达低于鳞癌组织，与He等[9]报道的结果一致。Bmi-1蛋白表达在食管鳞癌旁组织和食管鳞癌组织中呈逐渐上调趋势，食管鳞癌组织中存在Bmi-1蛋白高表达现象提示Bmi-1 蛋白与食管鳞癌的发生、发展相关。有研究表明Bmi-1蛋白的表达水平随着肿瘤分化水平的降低而升高， 即其表达水平越高， 肿瘤的生物学行为越差[10]。本研究显示Bmi-1蛋白高表达率与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴转移无关，而与TNM病理分期和浸润深度相关。即 Bmi-1蛋白在侵及外膜的食管鳞癌的表达明显高于侵及肌层者；TNM 分期中的Ⅲ期患者 Bmi-1 蛋白表达高于Ⅰ/Ⅱ期患者(P<0.05)。以上结果提示食管鳞癌组织中 Bmi-1 蛋白高表达是判断食管鳞癌患者预后不良的参考指标之一。

本研究结果显示Bmi-1 蛋白与淋巴结转移无相关性，这有两种可能性，(1)Bmi-1的表达确实与食管癌的淋巴结转移无关，(2)样本例数不够多。因此，有必要扩大样本量的研究，以进一步证实这一论断。另外，本研究还提示Bmi-1过表达在食管鳞癌的发生中可能具有重要意义，Bmi-1基因检测的进一步深入研究应针对其作为预后分子靶标、治疗相关敏感性预测的价值做出判断，进而为治疗提供新靶点。

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