杨秀惠 严延生



肠道病毒71型（EV71）感染性克隆的构建

杨秀惠 严延生

福建省疾病预防控制中心

肠道病毒71是小RNA病毒科肠道病毒属中的一员，常在婴幼儿中引起手足口病的大范围爆发流行，并能导致重症、甚至死亡病例的发生。1998年中国台湾地区129106例的手足口病例及78例死亡主要由EV71引起[1]，2008年和2009年以EV71感染为主引起的手足口病在中国大陆多个省市流行，并导致479名儿童死亡[2]。这些手足口病疫情使越来越多的研究针对EV71致病机制、病毒变异与毒力以及疫苗开发。

反向遗传技术为在DNA水平上对RNA病毒进行研究和操作提供了极为方便有用的工具。本研究构建了EV71全长cDNA克隆,并将体外转录得到的RNA转染RD细胞,成功获得拯救病毒，为进一步研究EV71病毒基因功能、基因变异与病毒毒力关系、基因疫苗等研究以及防控该病奠定良好的基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1毒株与细胞

EV71病毒株FJ08149是2008年从一手足口病病例疱疹液分离获得，经鉴定为EV71 C4基因亚型。RD细胞由中国疾病预防控制中心脊灰实验室惠赠。

1.1.2主要试剂

长片段扩增Primescript RT-PCR Kit购自Takara公司；PCR-XL- TOPO TA载体 购自Invitrogen公司；RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 购自Promega 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 购自Qiagen公司；EV71单克隆抗体购自Chemicon公司；FITC标记的二抗购自Dako公司。

1.2 引物设计与合成

根据FJ08149株的序列和酶切位点,设计了一对引物,上游引物 EV71-5T7在其5'引入T7启动子序列及I酶切位点，下游引物EV71-3RM在其5'端引入52个Poly(T)及I酶切位点。由Takara公司合成。

1.3 RT-PCR扩增基因片段

按照QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂说明提取病毒RNA,最后用适量无RNA酶的双蒸水溶解。根据长片段Primescript RT-PCR Kit说明书，先以EV71-3RM为反转录引物，在42℃反应1小时反转录全长cDNA，然后利用Takara Ex Taq HS进行基因组全长扩增，PCR反应条件为:95℃预变性3 min；98℃ 10sec , 68℃ 9min，40个循环；72℃ 10min。反应产物在0.7%琼脂糖中电泳进行检验。

1.4 全长cDNA 的构建与鉴定

RT-PCR扩增产物经电泳后纯化，以TA克隆方法将带有T7启动子识别序列的基因组全长连入TOPO-XL-PCR载体中，用I和I酶切鉴定是否插入目的片段。

1.5 体外转录与转染RD细胞

用Ⅰ和I将有目的片段插入的质粒进行双酶切线性化，纯化后按照T7体外转录试剂盒说明在体外转录出RNA，用RNeasy mini kit（Qiagen）试剂盒进行RNA纯化后,加30ul无RNA酶的双蒸水洗脱, 定量。按照Transfection reagent说明书要求把RNA转染到培养于6孔细胞板RD细胞中, RNA含量为2μg/孔。转染后每天观察细胞，待细胞病变（CPE）达到75%及以上或观察7天后，收获细胞进行鉴定与传代。

1.6 拯救病毒的鉴定

1.6.1 RT-PCR鉴定及VP1序列测定

用EV71－S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)诊断引物对拯救病毒进行鉴定。应用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)扩增包括VP1全长在内的1082bp产物，并进行序列测定分析。

1.6.2间接免疫荧光试验鉴定

CPE达到75%及以上或观察7天后，收集细胞及上清，2500rpm离心10min，取细胞沉淀用无菌PBS洗2次后，重悬细胞沉淀，滴加到荧光片，用丙酮将其固定，蒸镏水清洗1次后加入EV71单克隆抗体，37℃湿盒中孵育1 h，PBS 洗涤3次。加入用1∶6000伊文斯兰以1∶40 稀释的FITC标记的兔抗鼠二抗，37℃湿盒中孵育1h，PBS洗涤3 次后甘油封孔，镜检。

1.6.3拯救病毒效价测定

获得拯救病毒经RD细胞传一代扩增后，与母本病毒同时进行TCID50测定。详细方法及步骤参见《WHO脊髓灰质炎病毒实验室手册》[3]。

1.6.4电镜观察

获得拯救病毒经RD细胞传一代扩增后，反复冻融3 次，4500r/min 离心30 min，取上清浓缩5倍后，以1%加入EV71特异性抗体37 ℃孵育2h后，4℃过夜，10000r/min离心30 min，以PBS重悬沉淀，点样、负染，电镜观察。

2 结果

2.1 全长cDNA克隆的构建

利用引物EV71-5T7和EV71-3RM，从FJ08149病毒上清扩增出EV71基因组全长约7.5kb，见图1A（marker不够清晰）。应用TA克隆技术，将EV71基因组全长连接入PCR-XL-TOPO TA载体中，构建重组质粒，经I和I双酶切鉴定，FJ08149T5和FJ08149T25两个克隆质粒均有目的基因插入，见图1B,目的基因约7.5kb，载体大小为3.5kb。

A: FJ08149株基因组PCR扩增产物

2.2 体外转录制备感染性RNA

应用I和I双酶切，从pFJ08149T5和pFJ08149T25克隆质粒中切下含有T7启动子的基因组DNA。并将此片段作为体外转录模板，通过T7 RNA聚合酶系统，体外转录成RNA，经电泳鉴定，转录的RNA达到预期的7.5Kb大小，见图2。

1.RNA Marker RL10,000 2. pFJ08149T5 3.pFJ08149T25

2.3 病毒的拯救

转录RNA转染RD细胞后72小时，即可见到典型的肠道病毒CPE，见图3A，CPE呈逐日增多，7天后将转染细胞培养上清以20%比例传代，第3天CPE达到75%以上。对照细胞培养7天均仍保持正常形态，见图3B。

A.转染pFJ08149T5后的RD细胞 B. 正常的RD细胞

2.4 拯救病毒的鉴定

2.4.1间接免疫荧光鉴定

拯救病毒、拯救病毒传1代后和母本病毒株用EV71单克隆抗体进行免疫荧光检测，均可见到特异性的荧光，见图4A，而细胞对照无荧光产生，见图4B。

图4 拯救病毒的间接免疫荧光鉴定

2.4.2RT-PCR鉴定及序列分析

拯救病毒培养上清用EV71-A和EV71-S、EV71-F和EV71-R进行扩增，均得到预期大小的目的片段，约226bp和1082bp，见图5。将VP1全长序列测定分析，拯救病毒与母本病毒891个碱基完全一致。

图5 拯救病毒的RT-PCR鉴定

2.4.3拯救病毒毒力效价测定

将拯救病毒与母本病毒同时进行病毒效价测定，结果pFJ08149T5的效价为105.25TCID50/0.1ml,pFJ08149T25效价为107.25TCID50/0.1mL，母本病毒FJ08149的效价为107.505TCID50/0.1mL。其中pFJ08149T25与母本病毒对细胞的感染力相近，而pFJ08149T5约低100倍。

2.4.4病毒粒子的形态

浓缩后的FJ08149T5拯救病毒与EV71抗体作用后，形成免疫复合物，经负染色，电镜下观察到球形病毒粒子，直径约22nm，见图6。

图6 拯救病毒的免疫电镜

3 讨论

自1981年Racaniello VR和Baltimore D 首次应用反向遗传学技术成功拯救出脊髓灰质炎病毒（PV）后[4]，翻开了RNA病毒研究的新篇章，实现了在DNA水平上研究RNA病毒。通过构建cDNA感染性克隆，应用DNA基因操作方法，如定点突变、重组、缺失和嵌合等手段，研究拯救病毒基因水平的改变对表型的影响，进而达到对病毒基因功能与结构、致病机制、表达调控、分子免疫机理等的全面认识，开发出新型疫苗。日本学者Arita等，于2005年首先构建了EV71标准株BrCr的感染性克隆，然后利用基因置换，引入PV疫苗株（Sabin I）影响温度敏感与病毒毒力的突变位点，在猴子模型上证实了温度敏感的病毒株对猴子毒性减弱[5]；2008年，他们又在NOD/SCID鼠模型中证实了几个决定温度敏感的突变位点在神经毒力减弱中起协同作用[6]。2008年以来EV71在中国大陆流行，迫切需要利用本土流行株构建感染性克隆，为研究其致病机理、病毒变异与毒力关系以及疫苗的研究提供技术支持。

由于PV等小RNA病毒的基因组是单股正链RNA分子，裸RNA分子就具有感染性，且基因组较小，如EV71等肠道病毒属仅有7.5Kb大小，无帽子结构。理论上构建其感染性克隆可能较为容易，但在实际操作中仍然面临着不少的困难。首先需获得完整基因组的cDNA序列，先前基本上采取分段扩增后逐步克隆拼接出完整的cDNA序列，操作过程烦琐，且多次克隆、连接也给基因序列突变增加了机率。本研究中通过长片段RT-PCR一次性扩增出全长基因组，一次克隆操作以尽量减少可能引入序列变异。第二，基因组3’端需有足够长的Poly(A)尾，一定长度的Poly(A)对维持基因组稳定性及保证其感染性均有作用[7]。据报道，PV的Poly(A)如果少于20个，RNA的感染性比野生株会低20倍[8]。Sarnow等对3’端Poly(A)组成不同对PV体外转录本感染性影响的研究得到，Poly(A)尾越长其感染性越接近野生株，但非同源聚合序列反而使其感染性降低[7]。本研究设计时利用3’端引物直接带入52个Poly(A)尾和一个I酶切位点，达到保证感染性同时可进行线性化的目的。第三，保证基因组忠实性，减少其它非基因组序列引入。本研究直接将T7启动子特异性识别序列通过引物精确加到基因组5’端，并带入I酶切位点，转录前通过双酶切，避免将载体序列引入。第四，克隆扩增时如何避免因细菌增殖可能引起的序列变异，导致序列缺失或插入从而导致基因组序列不完整性。在本研究过程中也曾发现过类似的情况，因此采用了28℃、150rpm/min的低温低转速的优化培养条件，这是乙型脑炎病毒等其它感染性克隆构建过程也曾采取的措施[9]。本研究还发现如果基因组正向插入到载体T7启动子下游，不仅细菌增殖缓慢且量少，质粒拷贝数低，且转染也无感染性；而如果基因组以反向插入，则细菌不仅增殖快量大，质粒拷贝数高，且所获得的几株感染性克隆均为此反向插入的。这是否因不同方向插入时，潜在表达的蛋白质不同导致的，有待于进一步深入研究分析。

本研究应用本地分离株成功地构建了中国大陆流行C4基因亚型EV71感染性克隆，转染RD细胞成功获得了拯救病毒，经鉴定与野生株具有相似的遗传特性与生物学性状。此感染性克隆构建成功，可为下游研究提供了技术支持。

[1] Lin TY, Twu SJ, Ho MS, et al .Enterovirus 71 outbreaks, Taiwan: occurrence and recognition. Emerg Infect Dis. 2003,9: 291–293.

[2] http://www.chinacdc.net.cn/n272442/n272530/n272757/appendix/doc7307.doc

[3] 世界卫生组织.脊髓灰质炎实验室手册[R].第4版.中国疾病预防控制中心：北京, 2004：78-96.

[4] Racaniello VR, Baltimore D.Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in Mammalian cells. Science. 1981，214(11)：916-919.

[5] Arita M, Shimizu H, Nagata N, et al. Temperature-sensitive mutants of enterovirus 71 show attenuation in cynomolgus monkeys. J Gen Virol. 2005，86：1391-1401.

[6] Arita M, Ami Y, Wakita T, et al. Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin 1 strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model. J Virol, 2008，82(4)：1787-1797.

[7] Sarnow P.Role of 3’-end sequences in infectivity of poliovirus transcripts made in vitro. J Virol, 1989， 63(1)：467-470.

[8] Spector DH，Baltimore D. Requirement of 3'-terminal poly(adenylic acid) for the infectivity of poliovirus RNA.Proc Natl Acad Sci，1974，71：2983-2987.

[9] 黄莺,贾丽丽,孙志伟,等.流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得[J].病毒学报，2003，19（4）：313-319.