修文琼 刘光华 沈晓娜 王美爱 谢剑锋 康育兰 翁其珠 严延生



中国福州呼吸道感染患儿中检测到WU多瘤病毒

修文琼1刘光华2沈晓娜1王美爱1谢剑锋1康育兰2翁其珠2严延生1

1.福建省疾病预防控制中心 2.福建省妇幼保健院

呼吸道感染是造成全球5岁以下儿童死亡的主要疾病，也是儿童住院治疗的首要疾病。迄今，仍约有30%的小儿呼吸道感染原因不明[1]。人类呼吸道病毒种类繁多，小儿呼吸道感染可由不同病毒引起，以往的研究证明婴幼儿急性呼吸道感染的主要病毒病原是人类呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(甲、乙型) 、副流感病毒(主要是Ⅰ、Ⅲ型) 、肠道病毒和腺病毒。最近几年，从人类呼吸道标本中又鉴定出7种先前未知的病毒，分别是人偏肺病毒[2]，SARS冠状病毒[3]，冠状病毒NL63[4]，冠状病毒HKU1[5]，人博卡病毒[6]，以及2007年刚被发现的KI多瘤病毒（KIPyV,)[7]和WU多瘤病毒(WUPyV,)[8]。WUPyV和KIPyV属于多瘤病毒科的两种人类呼吸道新病毒，含有双链环状基因组DNA结构，是一类小DNA病毒。

为了了解这几种呼吸道新病毒在本地区小儿中的感染情况，我们从2007年11月至2008年10月采集了在福建省福州市妇幼保健院因呼吸道感染住院的重症监护病房的57例小儿鼻咽抽取物标本，并用分子生物学方法对几种呼吸道病毒进行检测。另外，对一例有腹泻症状的急性呼吸道感染门诊患儿的痰、呕吐物和排泄物标本分别进行了疑似病毒的检测。

1 对象与方法

1.1 实验对象

采集57例因下呼吸道感染住院患儿（临床诊断为支气管炎或肺炎、毛细支气管炎）的鼻咽抽取物（NPA，nasopharyngeal aspirates）标本及一例门诊患儿的痰、呕吐物标本和粪便标本。患者年龄从20天到4岁，平均年龄5.3月，中位年龄2.1月。82.5%为男孩，17.5%为女孩。

1.2 实验方法

1.2.1标本处理

在3mL DMEM采样液中加入采集的NPA标本，反复吹打在40C条件下送达的NPA标本，加入双抗（含200U/mL青霉素，200U/mL链霉素），分装数管，置-700C保存。呕吐物和粪便标本同样分装数管，置-700C保存。如果粪便标本较浓，可制备10%便悬液。具体方法是将粪便标本加到1.5mL Ep管中，加入生理盐水振荡3次，每次10sec，然后静置10 min，8 000 g离心5 min，吸上清进行下一步实验或置-700C保存。

1.2.2病毒DNA的提取

提取前将标本冻融两次后，10 000 g离心15min，吸取上清。采用德国Qiagen 公司的QIAamp Viral DNA Mini Kit，按其手册所提供的方法提取病毒DNA。

1.2.3 PCR扩增鉴定

一对检测引物[8]为AG0044（5‘TGTTACAAATAGCTGC AGGTCAA），AG0045（5‘GCTGCATAATGGGGAGTACC），扩增产物为VP2蛋白的一段，长250bp；另一对确认引物[8]为AG0048（5‘TGTTTTTCAAGTATGTTGCATCC），AG0049（5‘CACCCAAAAGACACTTAAAAGAAA），扩增产物为大T抗原（LTAg）的一段，长244bp。引物由TaKaRa（大连）有限公司合成。

1.2.4 PCR产物的纯化及序列测定

采用德国Qiagen公司的QIAquick Gel Extraction Kit，按其手册所提供的方法纯化PCR产物。对纯化产物进行TA克隆，克隆质粒为pMD18T。转化DH5α感受态细胞，挑取将PCR产物片段克隆到质粒的白色菌落，提取质粒后测序。

1.2.5基因比对分析

将所测得的序列与GenBank中多株WUPyV的基因片段的氨基酸序列进行比对分析。多序列比对由ClustalX完成，进化树分析采用Phylip3.65软件。同时也对推导出的氨基酸序列进行比对分析。所测得的4株WUPyV部分基因或全基因组的GenBank序列号是FJ890979（FZ13株）, FJ890980（FZTO株）, FJ890981（FZ18株）, FJ890982（FZTF株）。

2 结果

2.1 PCR检测

从57例鼻咽抽取物（NPA）标本中检测到3例WUPyV感染阳性标本，编号分别为FZ9、FZ13和FZ18，阳性率为5.3%。在另一门诊病例的痰、呕吐物标本和粪便标本中也检测出WUPyV感染，编号分别为FZTO和FZTF。若加上这一门诊病例，58例呼吸道感染患儿中，WUPyV感染的检出率为6.9%。用检测引物和确认引物扩增的产物的相对分子量分别是250bp和244bp，与预期结果相符。

2.2 扩增产物序列测定和比较分析

对5株WU多瘤病毒中的两株FZ18株和FZTF株进行全基因组序列测定，并对另两株病毒FZ13株和FZTO株的大T抗原和小T抗原的部分编码基因进行序列测定，所测定的FZTO株与FZTF株的基因序列是一致的，分别对应同一门诊患儿的呕吐物和粪便标本。将FZ18株与FZTF株基因的250bp检测片段与已上传到GenBank的国内外几株WUPyV的基因片段（澳大利亚的B0、B3、B7、B9、B12株，美国的S1、S2、S3、S4株，韩国的KY-M-2338、KY-M-3293、KY-M-3302株，北京的BCH-004A、BCH-123A、BCH-312A、BCH-313A株，温州的CLFF株和兰州的LZ41株，对应GenBank序列号分别是澳大利亚的EF444549、EF444558、EF444580、EF444592、EF444557，美国的EF444550-EF444553，韩国的EF655820、EU041606、EU041608，北京的EU597008、EU754876、EU754881、EU754882，温州的EU296475和兰州的EU304322）进行核苷酸和推导出的氨基酸序列的比对分析。图1显示中国福建福州的FZ18株和FZTF株与其它已报道的18株WUPyV的亲缘关系。可见相对而言，福州FZ18株与的北京BCH-004A株距离较近，FZTF株则与兰州的LZ41株、温州的CLFF株、韩国的3株及参考株-澳大利亚的B0株和美国的S1-S4株关系较近。FZ18株和FZTF株基因的250bp检测片段与B0株相比，FZTF株未发生突变，FZ18株的核苷酸序列在1545bp处有一碱基突变，推导出的氨基酸序列亦不同,基因的此处突变为M324I。FZ18株的此处突变与北京BCH-004A株相同。

图1 福建2株人WU多瘤病毒（FZ18、FZTF）与Genbank中其它18株人WUPyV的VP2基因氨基酸序列的亲缘关系树

2.3 阳性病例的临床症状

这5例患儿都为男童。FZ18号患儿才48天，2008年一月份发病，咳嗽两天，加重，气促半天；FZ13号患儿4个月，反复咳嗽10天以上，加剧，伴气喘2天，临床诊断为支气管肺炎。FZ9号患儿2个月，咳嗽7天，加剧，伴气喘、气促1天；FZ13号和FZ9号病儿都在2007年12月份发病。另一患儿是门诊病例，3岁半，也是2007年12月初发病，突然呕吐，腹泻，伴有咳嗽，医生诊断为急性病毒性胃肠炎。分别收集他的痰、呕吐物（FZTO）和排泄物（FZTF）进行检测和测序，所测得的序列是一致的。5个月后，这位患儿又咳嗽、呕吐和腹泻，但未在其痰、呕吐物标本和排泄物标本中检测到WUPyV感染。总之，这几个患儿都在冬季发病，都有呼吸道感染症状，咳嗽等；有一门诊患儿还有胃肠道感染症状。在57例住院患儿中WUPyV感染阳性病例年龄中位数是2个月，平均数是2.6个月。

2.4 其它病毒感染情况

对这些标本也进行了两种常见呼吸道病毒-流感病毒（包括甲1、甲3和乙型）和呼吸道合胞病毒（RSV）及其它几种呼吸道新病毒：如人博卡病毒（HBoV）、人偏肺病毒（HMPV）和KI多瘤病毒（KIPyV）的检测。对粪便标本进行了人A组轮状病毒（RVA）的检测。检测到2例甲3亚型流感病毒、1例乙型流感病毒感染和32例RSV感染及2例HBoV感染、1例KIPyV感染。也检测到两种病毒的混合感染，其中3例检测出WUPyV的住院患儿都检测出与RSV的混合感染；1例检测出HBoV的患儿也检测出与乙型流感病毒的混合感染；另一例检测出甲3亚型流感病毒与RSV的混合感染。WUPyV与其它呼吸道病毒混合感染的检出率是75.0%。

3 讨论

多瘤病毒在全球大多数哺乳动物和鸟类中都存在，其中研究最多的感染动物的多瘤病毒是鼠多瘤病毒和猴空泡病毒（SV40）。1971年，两种人类多瘤病毒BK和JC病毒分别从进行同种异体移植的慢性肾盂肾炎病人的尿和进展性多病灶脑白质脑病的病人脑中分离出。BKPyV和JCPyV可引起持续性感染，在有免疫力的人中通常无症状，但在那些免疫抑制的病人中可导致严重疾病[9]，这两种病毒均与肿瘤的发生有关，有报导在呼吸道分泌物中也发现BKPyV[10]。2008年,在人类皮肤癌细胞中发现了一种多瘤病毒科新病毒MCPyV ()[11]，最新报导在人呼吸道分泌物中也发现MCPyV[12]。在人类粪便标本中也发现有BKPyV, JCPyV[13]和KIPyV[7]。最近报导在儿童急性胃肠炎的粪便标本中发现WUPyV[14]，我们也在一位既有呼吸道感染症状又有急性胃肠炎症状的门诊病人的痰、呕吐物和粪便标本中检测到WUPyV感染，而从这位患儿的呼吸道标本中未检测到常见呼吸道病毒如RSV和流感病毒的感染，也未检测出其它几种呼吸道新病毒。这表明虽然WUPyV是呼吸道病毒病原，但也可在胃肠道的排泄物中存在，WUPyV似乎既可引起上、下呼吸道感染，也可引起腹泻。以前的研究也表明了WUPyV感染既表现出呼吸道症状，也表现出胃肠道症状[7,15-17]。因此，推测WUPyV类似于人类其它多瘤病毒，既可通过呼吸道也可通过胃肠道传播。我们在另3例检测出WUPyV感染的住院患儿中都检测出了RSV的感染，因此WUPyV在人类呼吸道感染中的临床意义有待进一步研究。

2007年报道在美国华盛顿地区鉴定WUPyV的阳性率为0.7%[8]，在密苏里地区为2.7%[18]，在澳大利亚为3.0%[8]，在加拿大为2.5%[19]，在韩国WUPyV的阳性率高达7.0%[20]，并且有混合感染情况出现，与其它一些呼吸道病毒混合感染的检出率是67.6%。中国最早报道了浙江一例WUPyV感染[21，22]，兰州的感染率是2.2%[23]，北京的感染率是2.4%[24]。2008年报道WUPyV在法国的感染率是2.4%[25]，德国的感染率是4.9%[26]，英国的感染率是1.08%[27]，并且有混合感染情况，与RSV、HBoV和HMPV混合感染的检出率是75%，类似于我们的检测结果。由于我们都没有检测鼻病毒、腺病毒、冠状病毒和肠道病毒等其它几种呼吸道病毒，否则混合感染的检出率更高。近来，美国报道在有呼吸道感染症状的儿童中WUPyV的阳性率为7.1%，无症状儿童中的阳性率为6.3%[28]；荷兰报道在儿科重症监护病房，有或无呼吸道感染症状的儿童中WUPyV的阳性率为2.6%[29]。在我们的研究中，同一门诊病人经过5个月后（次年4月份），又出现呼吸道感染和腹泻症状时，但我们没有再次从他的痰液、呕吐物或排泄物标本中检测到WUPyV，表明WUPyV没有潜伏在其体内形成持续性感染。显然WUPyV的感染可发生在生命早期，也可能是使呼吸道疾病加重的一个因子。但WUPyV作为人类病原以及它的致病性有待进一步研究和阐明。

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