李永裕 陈建烟 关夏玉 温凤英 吴少华 王曾金

微波辅助提取余甘多糖的工艺研究

李永裕1，2陈建烟1，2关夏玉1温凤英1，2吴少华1，2王曾金1

1.福建农林大学园艺学院 2.福建农林大学园艺植物天然产物研究所

余甘多糖具有清除自由基、抗氧化和抗肿瘤的生物活性，但对余甘多糖提取工艺的研究报道较少。该文采用微波前处理-热水浸提新工艺提取余甘多糖，通过单因素和正交实验研究了微波时间、微波功率、热水浸提温度和浸提时间对余甘多糖得率的影响。结果表明，多糖得率的主要影响因素及其顺序为：热水浸提温度、热水浸提时间、微波时间、微波功率。在所考察试验范围内，余甘多糖的最佳提取工艺条件为：微波时间60s、微波功率480W、热水浸提温度90℃、热水浸提时间4h，在此条件下，余甘多糖得率为7.94%。

余甘多糖 微波辅助提取 正交试验 工艺条件

余甘（L.）是大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（）植物，是世界卫生组织指定在世界范围内推广种植的3种保健植物之一[1]，1998年被我国卫生部确定为药食两用植物。余甘起源于印度和缅甸，主要分布在印度、中国、缅甸、马来西亚、巴基斯坦等南亚热带地区，以中国的产量最大[2]，在福建已成规模化栽培。现代药理学研究结果表明，余甘具有抗肿瘤、抗衰老、抗突变、降血脂、降血压、保肝、抑菌、抗炎等功效，全世界约有17个国家的传统药物体系用余甘果实进行配伍，中国约有16个民族使用该药[3]。有研究表明，余甘多糖具有清除自由基[4]、抗氧化和抗肿瘤的生物活性，可抑制癌细胞生长[5,6]，值得做进一步的深入研究和开发应用[3]。为充分发挥地区优势，本课题组以余甘主栽品种“粉甘”果实为研究对象，探索低成本、高收率的余甘多糖提取工艺。

郑宝东等[7]用热水法研究了余甘多糖的提取工艺，但传统的提取方法存在费时、溶剂用量大、提取效率低等缺点[8]。近年来，微波辅助提取（MAE）技术在多糖提取工艺领域得到了广泛的应用，受到人们的青睐，MAE技术具有溶剂消耗少、选择性好、提取速度快、产品质量好、可提高收率、提高提取纯度及成本低等许多优势[8,9]。该技术在龙眼多糖、龙葵多糖、灵芝多糖、橘皮果胶等天然产物多糖的提取中已获得了成功的应用[8-11]。本文采用微波前处理与热水浸提耦联的新工艺提取余甘多糖，通过单因素考察及正交实验确立了有效的余甘多糖微波前处理-热水浸提工艺，并证实了这一工艺的优越性。本文的研究工作将为余甘多糖的工业化提取及应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜余甘果实采自福建省惠安县紫山镇蓝田村。选择无病虫害、无畸形的余甘果实，进行清洗、去核、40℃烘干等前处理，干燥果肉用多功能粉碎机磨成粉末，过40目筛。参照Sun等[12]的方法，用80%乙醇70℃热处理原料2次，除去单糖、低聚糖、色素和多肽等物质，同时灭酶活防止酶在提取过程中对多糖的降解。抽滤，真空干燥，得到预处理余甘果肉干粉，置于-40℃冰箱中备用。

1.2 试剂及仪器

葡萄糖、苯酚、浓硫酸、95%乙醇等均为国产分析纯。本试验用水均为双蒸水。

LibraS22紫外可见分光光度计（英国Biochrom公司）；AllegraTM64RCentrifuge台式高速冷冻离心机（美国BeckmanCoulter公司）；G80L20CSL-DG微波炉（广州Galanz公司）；DK-S28型电热恒温水浴锅（上海精宏公司）；FDU-1200冷冻干燥机及旋转蒸发仪（日本EYELA公司）。

1.3 试验方法

1.3.1多糖含量测定

多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法[13]。称取干燥至恒重的葡萄糖60mg，定容至500mL，摇匀；分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6和1.8mL上述溶液于试管中，用蒸馏水补至2.0mL，顺序加入1mL6%苯酚和5mL浓硫酸，振荡摇匀显色后放入冰水中冷却。在波长490nm处测量其吸光度。以葡萄糖含量为横坐标、吸光度为纵坐标作图。绘制得到标准曲线：y=6.6444x+0.0432（R2=0.9974）。

13.2单因素试验

参照杨翠娴等[8]和李顺峰等[14]的方法，余甘果肉干粉用一定比例去离子水匀浆，置于微波炉中先进行短时高频微波前处理；微波前处理后的干粉加入一定比例去离子水后，在搅拌条件下采用热水浸提，单因素试验时其它因素水平不变。提取液8000g离心10min，取上清液加入5倍体积的95%乙醇，静置，8000g离心10min，最后沉淀用去离子水溶解并定容至100mL。吸取上述溶液2.0mL，于25mL比色管中，其余步骤同1.3.1。每组试验重复3-5次，取其平均值。依据标准曲线，计算多糖得率。

多糖得率（%）=多糖提取量/余甘干粉重量×100

因素选择：分别以不同微波功率、微波时间、热水浸提时间和液料比作为多糖提取得率的影响因素。以传统的热水浸提方法[7]（料液比1∶20，100℃水浴5h）为对照。

1.3.3正交实验

根据单因素试验结果，以微波功率、微波时间、热水浸提时间和浸提温度4因素，选9(34)表做正交实验，得出微波辅助提取余甘多糖的最佳工艺。选用因素及水平见表1。

表1　正交实验的因素及水平选取

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1微波前处理工艺条件的影响

不同溶剂、微波功率和微波时间对提取率有明显的影响[8,15]。由于目标提取物为水溶性多糖，故选定提取介质为水溶剂。在本试验中，固定后续热水浸提工艺中的料液比为1∶20、浸提温度90℃、浸提时间2h，分别考察不同微波前处理功率和处理时间对多糖收率的影响。

（1）微波功率：固定微波前处理时间为60s，考察不同微波前处理功率对多糖提取率的影响，结果表明（图1），初期余甘多糖收率随微波功率的增大而急剧增加，随着微波辐射功率加大，多糖得率反而下降，这是因为过高的微波功率容易导致细胞内快速失水，升温过快，造成多糖结构及活性的破坏[8]。

图1　微波功率对多糖得率的影响

（2）微波作用时间：微波连续作用时间与试样质量、溶剂体积和微波功率有关，通常10~100s即可达到要求的萃取温度[16]。在固定微波前处理功率为480W的条件下，本文考察了不同处理时间对多糖提取率的影响，结果如图2所示。当微波前处理时间为60s时，余甘多糖的收率最高。过长的处理时间易引起溶剂温度过高甚至暴沸，导致目标产物损失，收率降低[16]；同时，过多的辐射能量易导致多糖结构中的部分乙酰基、硫酯键断裂，改变其有机结构的三维构像及生物活性，发生水解等不利反应[8]。

图2　微波前处理时间对多糖得率的影响

2.1.2后续热水浸提工艺条件的影响

余甘果肉干粉匀浆经功率480W、时间60s的短时高频微波前处理后，加入一定比例去离子水进行热水浸提，分别考察了后续热水浸提时间、浸提温度和料液比对多糖收率的影响。

（1）热水浸提时间：在料液比1∶20，温度为90℃的恒温水浴中分别浸提1h、2h、3h、4h、5h，测定结果如图3所示。由图可知，随着浸提时间的延长，多糖得率显著增加。在浸提时间为1~2h时，多糖得率由5.95%增加到7.03%，增加了18.17%（<0.01）；而在浸提时间为2h~5h内，得率增加平缓，仅提高了7.54%，考虑到能耗，故选较优浸提时间为2h。

图3 热水浸提时间对多糖得率的影响

（2）热水浸提温度：在料液比1∶20的条件下，控制浸提温度为60、70、80、90、100℃的恒温水浴中提取2h，测定结果如图1。随着浸提温度的升高，多糖得率也逐渐增加，但温度升高到90℃以后，多糖得率不再增加，反而有所下降，温度过高可能会造成多糖的降解[17]，故选择90℃为提取温度较优值。

图4 浸提温度对多糖得率的影响

（3）料液比：在后续的热水浸提实验中，料液比对余甘多糖提取率影响不显著（图5），因此本文在后面的正交实验设计中不考察液料比对微波辅助提取余甘多糖的影响。

图5 料液比对多糖得率的影响

2.2 正交实验

由于影响微波前处理和热水浸提的微波功率、微波时间、热水浸提时间和浸提温度4个因素间能够互相影响，因此本文在单因素水平试验结果基础上，设计4因素3水平正交实验，确定微波前处理-热水浸提的最佳工艺条件。正交实验结果及其极差分析见表2，各因素水平趋势见图6。

表2　正交实验结果

图6　微波时间、微波功率、热水浸提温度和浸提时间对多糖得率的影响

正交实验和极差分析结果表明：

①不同因素对多糖提取得率皆有影响。从图6可见，采用微波时间60s，微波功率480W的短时高频微波前处理余甘果肉，促使余甘果肉细胞破裂和多糖物质浸出，多糖得率最高。后续用90℃热水搅拌浸提，有效促进了余甘多糖充分溶解于水中，多糖得率最高。在本文考察范围内，微波前处理-热水浸提法的最佳浸提时间为4h，随着浸提时间增加，多糖得率略有提高（图3），但从经济角度考虑，浸提时间不宜过长。

②从表2的试验结果看出，在9组试验中4号试验的多糖得率最大，相应的水平组合A2B1C2D3是当前最好的水平搭配。

③4个因素对多糖得率的影响程度不同。从表2的极差值看出，4个因素对多糖得率的影响顺序为：热水浸提温度>热水浸提时间>微波时间>微波功率，热水浸提温度（C）极差值最大是余甘多糖微波前处理-热水浸提工艺的关键控制因素。

④以多糖得率为目标，从4因素的水平趋势看出，微波前处理-热水浸提工艺的可能最佳水平组合为A2B2C2D3，即微波时间60s、微波功率480W、热水浸提温度90℃、热水浸提时间4h，在此条件下进行余甘多糖的提取，得率为7.94±0.15%，比组合A2B1C2D3的多糖得率7.60±0.29%略高。

3 结论与讨论

采用微波前处理-热水浸提新工艺提取余甘多糖，比传统热水浸提法[7]的多糖得率（6.17±0.19%）提高了28.54%，而且大大缩短了提取时间，节省成本。该工艺的优势在于先采用短时高频微波前处理破裂余甘果肉细胞，再通过后续热水浸提促进余甘多糖的充分溶解，从而提高多糖提取率，而且微波处理不会破坏多糖的结构[10,18,19]。微波提取过程中，微波辐射能穿透萃取介质，到达细胞内部，导致细胞内的极性物质，尤其是水分子吸收微波能，产生大量热量，细胞内温度迅速上升，液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破，形成微小的孔洞；进一步加热，导致细胞内部和细胞壁水分减少，细胞收缩，表面出现裂纹。孔洞和裂纹的存在使胞外溶剂容易进入细胞内，促进多糖等胞内物质溶出[15,20]，同时微波所产生的电磁场加速了多糖的热运动，缩短了其向溶剂界面的扩散时间[21]；此外，微波对溶剂水分子的加热作用可增加多糖的分散性，提高多糖物质在水中的溶解度，促进水不溶性多糖溶解于水[19,22]，提高了多糖的提取得率。

为进一步优化微波前处理-热水浸提工艺，本文考察了微波前处理的微波功率及处理时间，以及后续热水浸提温度和浸提时间等4个重要影响因素对余甘多糖提取率的影响。正交实验的方差分析结果表明，4个因素对余甘多糖提取率的影响均达到极显著水平。通过单因素和正交实验，本文确定了在考察试验范围内的余甘多糖最佳提取工艺条件为：微波前处理功率480W，微波处理时间60s，热水浸提温度90℃，浸提时间4h。在此工艺条件下，余甘多糖得率达7.94±0.15%。其中，热水浸提温度是工艺的关键控制因素。本工艺研究对于余甘多糖的产业化开发具有重要的参考价值。

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