厦门市环境监测中心站 姜欣欣



浮游植物叶绿素a测定方法的改进

厦门市环境监测中心站 姜欣欣

对分光光度法测定浮游植物叶绿素a的规范方法进行改进，利用丙酮加热过程提高了丙酮的萃取能力，并对丙酮浸渍提取时间进行了探讨，证明改进法更能有效地提取叶绿素a，并且该方法更为简便、容易操作，可以适用于叶绿素a的常规监测。

叶绿素a 测定方法 改进

在环境监测中，叶绿素a是表征浮游植物生物量的重要指标之一。通过测定浮游植物叶绿素，可掌握水体初级生产力情况，反映水体富营化程度。通常对淡水中叶绿素a的测定方法是采用《水和废水监测分析方法（第四版）》[1]，即下面所用的规范方法。该方法实验提取过程操作略显繁琐，样品在分析过程中多次转移，易造成样品的缺失，影响测定结果。在不影响丙酮萃取分光光度法原理的前提下，本文对规范法进行了改进，利用丙酮加热以提高萃取能力，并对若干个湖泊、湖库、河流水进行了对比实验。

1 实验部分

1.1 材料

微囊藻（），由实验室提纯培养，处于对数生长期。

1.2 主要仪器

过滤装置、抽滤瓶、真空泵、研钵、冰箱、乙酸纤维滤膜（孔径0.45μm）、离心机、722型分光光度计、具塞刻度离心管（10mL）、电热恒温水浴锅。

1.3 试剂

90%丙酮、碳酸镁粉末。

1.4 实验方法

1.4.1规范法

1.4.1.1水样浓缩。在抽滤器上装好乙酸纤维滤膜，在50kPa左右的负压下抽滤定量体积的水样。将抽滤完得到的滤膜，放入冰箱低温干燥6~8h。

1.4.1.2样品提取。取出干燥后的滤膜放入研钵，加入少量碳酸镁粉末和2~3mL90%丙酮，充分研磨提取叶绿素a。用离心机4000r/min离心20min。将上清液转入10mL比色管，用90%丙酮定容为10mL，摇匀。

1.4.1.3测定。将上清液在分光光度计上，用1cm光程的比色皿，分别读取750nm、663nm、645nm、630nm波长的吸光度，并以90%丙酮为空白，按如下公式计算叶绿素a含量：

叶绿素a（mg/m3）= [11.64×(663-750）-2.16×(645-750）+0.10×(630-750）]V1/V/δ

式中：V为水样体积（L），D为吸光度，V1为提取液定容后的体积（mL）, δ为比色皿光程（cm）。

1.4.2改进法

步骤(1)、(3)与规范法相同。

步骤(2)改为将干燥后的滤膜放入10mL具塞比色管中，加入少量的碳酸镁粉末，再加入90%丙酮10mL，旋紧管塞，于50℃恒温水浴锅中萃取5min。充分摇匀后，放入4℃冰箱在黑暗中浸渍提取5h。

2 结果与讨论

2.1 浸渍提取时间对叶绿素a浓度的影响

用改进法对微囊藻液的叶绿素a浓度进行不同提取时间的测定，并与规范法测定结果相比较，结果见表1。因规范法并未要求浸渍提取，这里采用浸渍0.5h的结果便于对比。

表1 改进法对微囊藻液不同提取时间的叶绿素a测定结果

该结果显示改进法的测定结果高于规范法。浸渍提取时间在2h内，叶绿素a的浓度快速上升，但之后在24h内上升缓慢并逐步稳定。可见，浸渍提取2～24h都是可以的。选取5h作为改进法的适宜的提取时间。

图1 叶绿素a浓度与提取时间的关系

2.2 规范法和改进法测定结果的统计比较

选取来自不同区域的含浮游植物丰富的5种地表水水样，每次量取100mL，采用两种方法进行平行测定，测定结果和统计见表2。

表2 规范法和改进法对比实验结果

从表2可以看出，改进法的测定结果普遍高于规范法。采用配对数据的显著性检验——t检验法，对表2的实验结果进行数学统计检验，统计结果见表3。由表中可知，经t检验求得︱t︱=3.02。给定α＝0.05，由t界值表查得t0.05(4)=2.78，︱t︱=3.02＞2.78，说明改进法与规范法测定结果有显著性差异。

表3　统计检验计算结果

３ 结论

规范法操作步骤略显繁琐，在样品的研磨过程中，本来含量就低的样品极易损失，不易收集。丙酮易挥发的特性，又使得研磨不能持久太久，造成规范法的测定结果偏低。改进法利用丙酮加热提升了丙酮的萃取能力，延长浸渍时间，促进藻类细胞破裂，使更多的叶绿素a从细胞中释放出来。在整个过程中，提取物始终保持在密闭的比色管中，保持了定容的体积，确保了叶绿素a浓度的可靠性。实验证明，采用丙酮加热、延长提取时间的方法可以提高对叶绿素a的提取，简便易操作的特点更适用于大批样品的数据监测。

[1] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法[M].北京:中国环境科学出版社,2002.