郑天慧，宋 波，姜自芹，刁桂珠，曾 蕊，吴 帅，拓 云，刘珊珊

(东北农业大学)

大豆花瓣蛋白双向电泳分析技术体系的优化*

郑天慧，宋 波，姜自芹，刁桂珠，曾 蕊，吴 帅，拓 云，刘珊珊＊＊

(东北农业大学)

双向电泳技术体系的优化是蛋白质组学研究的前提和基础.本文针对大豆花瓣含有大量色素和酚等干扰物质的现象，比较6种蛋白提取方法和2种蛋白裂解液配方，优化胶条范围和等电聚焦程序.结果表明:pH为4～7 IPG胶条适于大豆全花蛋白分离;TCA/丙酮+2D Clean Up试剂盒法去除杂质充分，提取的蛋白含量高、纯度好、分离效果佳、耗时短;蛋白裂解液采用5 mol/L尿素，2 M硫脲，2%CHAPS，2%SB3-10，5 mmol/L TCEP，20 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer为好;增加离心转速、时间和丙酮清洗次数能促进蛋白溶解，增加蛋白纯度，初步建立了一套适合大豆全花蛋白双向电泳分析的技术体系.

大豆花瓣;双向电泳;技术体系;优化

0 引言

花器官的正常发育是植物赖以繁衍的基础［1］，20世纪80年代以来，随着分子遗传学手段的运用，借助于现代生物技术结合模式植物拟南芥和金鱼草的花发育突变体，花发育研究在短短十几年内获得了突飞猛进的发展.目前，关于豆科植物花型的研究表明:金鱼草TCP domain基因家族的Cyc和Dich基因的主要功能是控制金鱼草花的不对称性发育和花器官的对称性.当Cyc和Dich基因双突变时，金鱼草花由两侧对称转变为辐射对称，其背部和侧部花瓣的形状也发生改变.另有报道，在豆科模式植物百脉根中TCP domain基因家族的Ljcyc2基因不仅参与了百脉根花背腹极性的建立，而且还参与了花序的发育，与花序的结构有关［2，3］.以上结果表明，通过遗传学的手段调整豆科植物花器的形状和大小是完全有可能的［4］.

大豆是一种严格的自花授粉作物，花器小，花多，花粉粘重，花朵开放前翼瓣和龙骨瓣紧紧包住雄蕊和柱头，花药和柱头不外露，异花间的昆虫传粉及风媒传粉难以进行，且易落花落荚，大田中大豆的异花授粉率不足1%，致使大规模的杂交育种需要大量的人力物力，极大的限制了大豆杂交育种的发展和杂种优势的利用［4-7］.探索大豆花型形成的分子基础，可以帮助我们明晰大豆花型发育的分子机制，从而能动的调控大豆花型的大小与结构，对提高大豆产量有重要的理论与实践指导意义.

蛋白质组学分析是目前分离、鉴定蛋白表达差异最为有效的研究手段，该技术不仅在人类以及越来越多的微生物中广泛研究，在植物中也越来越受关注［8-12］.双向电泳技术体系的优化是蛋白质组学研究的前提和基础，本文针对大豆花瓣含有大量色素和酚等干扰物质的现象，比较6种蛋白提取方法和2种蛋白裂解液配方，优化蛋胶条范围和等电聚焦程序，初步建立了一套适合大豆全花蛋白双向电泳分析的技术体系，为进一步深入开展大豆花型发育蛋白质组学研究奠定良好的技术基础.

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为2008、2009年种植于东北农业大学大豆育种试验田的常规大豆品种:东农53，开花盛期取大豆全花浸入液氮中，-80℃保存用于双向电泳分析.

1.2 蛋白提取方法与蛋白定量

1.2.1 蛋白的提取

TCA/丙酮法:参照 Damerval［13］等方法略做改进;苯酚法:参照Sarma［14］等方法，采用的蛋白提取液为 1 mM EDTA，2 mM AEBSF，2%PVPP;TCA/丙酮/酚法:在TCA/丙酮法基础上获得的蛋白沉淀再采用苯酚法进一步抽提;Mg/NP-40抽提液结合TCA/丙酮法:参照梁书剑［15］等方法略做改进;Mg/NP-40抽提液结合 TCA/丙酮/酚法:在Mg/NP-40抽提液结合TCA/丙酮法的基础上获得的蛋白沉淀再采用苯酚法进一步抽提.

1.2.2 蛋白质溶解

将花瓣蛋白干粉从-80℃中取出，加入蛋白裂解液，32℃孵育 1.5 h.20℃ 13000 g离心30 min，取上清即为蛋白溶液.用TCA/丙酮+2D Clean Up试剂盒法提取的花瓣蛋白样品，采用蛋白裂解液Ⅰ、Ⅱ进行溶解，用于蛋白溶解性的分析.蛋白裂解液Ⅰ和蛋白裂解液Ⅱ分别参照BIO-RAD双向电泳实验手册中的裂解液Ⅱ和Ⅲ.

1.2.3 蛋白质定量

参照Bradford法［16］定量蛋白，在紫外分光光度计595 nm波长下测定光密度OD值，绘制标准曲线，依照标准曲线计算出样品蛋白浓度.

1.2.4 单向SDS-PAGE 参照刘珊珊［17］等方法.

1.2.5 双向凝胶电泳

第一项聚焦(IEF)使用18 cm线性IPG干胶条，按照GE双向电泳操作手册操作，蛋白上样量250 μg，上样体积 400 μL，每胶条限流 50 mA，进行等电聚焦，IEF参数:设定见表2.等电聚焦结束后，取出胶条立即进行平衡，胶条依次在平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ中分别平衡14 min和15 min.第二向电泳使用 GE电泳系统，20 mA/胶条 30 min，40 mA/胶条直至溴酚蓝前沿抵达凝胶底部为止.电泳结束后将凝胶立即放入固定液中，固定15 min×2次，敏化30 min，去离子水漂洗15 min×3次，0.25%硝酸银染色20 min，去离子水漂洗1 min×2次，显色至条带清晰，1.46%EDTA 终止10 min，去离子水漂洗5 min×3次.凝胶以反射模式扫描，分辨率为300 dpi.使用ImageMasterTM2D Platinum 6.0软件分析蛋白凝胶.

2 结果与分析

2.1 大豆花瓣蛋白双向电泳分析蛋白提取方法的比较

在蛋白质组学的研究中，样品制备是至关重要的第一步，样品制备的成功与否决定了双向电泳的成败［18-20］.与DNA样品有几种相对固定的通用制备方法不同，双向电泳尚没有一种通用的蛋白样品提取方法，因此找出适合大豆花瓣蛋白质组学分析的蛋白提取方法至关重要［21，22］.

取相同鲜重花瓣样品，分别用苯酚法、TCA/丙酮法、TCA/丙酮/酚法、Mg/NP40-TCA/丙酮法、Mg/NP40-TCA/丙酮/酚法和 TCA/丙酮 +2D Clean Up试剂盒法提取大豆全花蛋白，结果如表1所示.从表1中可以看出，前5种方法所提取的蛋白中，TCA/丙酮/酚法和TCA/丙酮法的蛋白产量最高，分别为800.0μg，777.0μg，它们的蛋白提取率也是最高的，分别为15.54%，16.00%.但是，TCA/丙酮/酚法提取蛋白所需的时间12 h，是最长的，而TCA/丙酮法所需时间6h，耗时最短.TCA/丙酮-2D Clean Up试剂盒法提取蛋白的产量为915.0μg，提取率为 18.30%，是所有提取方法中最高的，而此方法提取蛋白所需要的时间为6.5 h，也相对较短.以上结果表明在相同鲜重花瓣样品的条件下，TCA/丙酮-2D Clean Up试剂盒法所提取的蛋白产量最多，蛋白提取量最高，所需时间较短且操作简单.

表1 不同蛋白提取方法提取效率的比较

2.2 不同蛋白提取方法单向SDS-PAGE凝胶图谱分辨率的比较

应用不同蛋白提取方法，提取相同重量的大豆盛花期全花蛋白，然后以相同的蛋白上样量进行单向电泳，其单向聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图1所示.

图1 不同方法提取大豆花瓣蛋白的单向电泳SDS-PAGE图谱

从图1中可以看出，TCA/丙酮法(第1泳道)在相对分子量200.0～14.3 kDa范围内提取的蛋白最全面;苯酚法(第2泳道)在分子质量97.2 kDa附近蛋白条带较少.TCA/丙酮/酚法(第3泳道)提取的蛋白在分子量87.0 kDa附近条带少.Mg/NP40-TCA/丙酮法(第4泳道)提取的蛋白在相对分子量97.2 kDa附近和44.3 kDa以下蛋白条带少.Mg/NP 40-TCA/丙酮/酚法(第 5泳道)提取的蛋白在分子量44.3 kDa以下范围，较TCA/丙酮法(第1泳道)、苯酚法(第2泳道)、TCA/丙酮/酚法(第3泳道)蛋白条带少.几种方法提取蛋白的单向SDS-PAGE表明，苯酚法，TCA/丙酮/酚法，Mg/NP40-TCA/丙酮法以及Mg/NP40-TCA/丙酮/酚法在蛋白提取方面均不充分，存在一定的缺陷，选择TCA/丙酮法提取的蛋白最全面.

2.3 不同蛋白提取方法双向电泳分析分辨率的比较

为了更清楚地分析几种蛋白提取方法的优劣，将 TCA/丙酮、TCA/丙酮/酚、Mg/NP40-TCA/丙酮、Mg/NP40-TCA/丙酮/酚、TCA/丙酮+2D Clean Up试剂盒法提取的蛋白分别进行双向电泳分析.凝胶经过银染后，可以看出这5种提取方法所提取的蛋白均能分离出几百个蛋白点，但效果有明显差异(图2).经过TCA/丙酮法(图2-A)提取的蛋白质斑点密集，但酸性端聚焦不好.而TCA/丙酮经过2D Clean Up试剂盒法(图2-E)处理过的蛋白样品分离效果好，图像清晰，尤其是能改变酸性端聚焦不好的效果，且多次实验重复性、敏感性、清晰度均良好，所以采用TCA/丙酮+2D Clean Up试剂盒法提取大豆花瓣蛋白是最佳的选择.

图2 不同蛋白提取法的双向电泳图谱

2.4 蛋白裂解液的比较

采用两种不同的蛋白裂解液(裂解液I和裂解液II)处理用TCA/丙酮+2D Clean Up试剂盒法提取的蛋白样品，然后进行双向电泳分析，结果如图3.可以看出，对于相同的蛋白样品，不同裂解液的溶解性及分辨率差异显著，裂解液Ⅱ(如图3-A)对蛋白的溶解能力比裂解液I(如图3-B)的溶解力强.应用ImageMasterTM2D Platinum 6.0软件对双向电泳图谱进行分析处理，识别出相同区域裂解液Ⅱ(如图3-C)蛋白点数为28个，裂解液Ⅰ(如图3-D)蛋白点数仅为10个.由此可见，对于TCA/丙酮+2D Clean Up试剂盒法提取的蛋白样品，裂解液II的溶解性更强，分辨率更高.

图3 不同裂解液溶解性及分辨率局部放大比较图

2.5 大豆花瓣双向电泳技术体系的优化确定

2.5.1 胶条范围的确定

因为没有前人做过大豆花瓣双向电泳的相关研究，所以我们先用宽pH范围的3～10、线性梯度胶条观察大豆花瓣蛋白的整体分布，结果如图4.从图中可以看出，大豆花瓣蛋白的等电点多数集中分布于pH 4～7范围内，所以，确定大豆花瓣双向电泳分析选用18 cm pH 4～7范围、线性梯度的胶条.

2.5.2 水化

等电聚焦前的胶条水化分为主动水化和被动水化.主动水化是给胶条两端加上一个较低的电压，可以促进大相对分子质量(200.0～97.2 kDa附近范围)的蛋白进入胶条，但同时会损失一部分小相对分子质量蛋白.被动水化则是不加电压，可避免因主动水化而损失小分子量蛋白，一般室温20℃左右，多采用被动水化.双向电泳检测(图4)结果表明:大豆花瓣蛋白在分子量97.2～200.0 kDa附近几乎没有蛋白，所以本试验IPG胶条水化时选择被动水化，水化16 h.水化后的胶条大约0.5 mm厚，水化盘中几乎没有样品，说明样品已经完全被胶条吸收.

图4 大豆花瓣蛋白双向电泳图谱(pH 3～10胶条)

2.5.3 等电聚焦程序

大豆花瓣中的干扰物质较多，提取的蛋白质溶液中仍会存在一些盐类的干扰物质.为了充分除盐，将聚焦开始的低压除盐的时间选择了加倍.由于该实验样品的前期处理良好，第四步聚焦的电压能上升至10000 V，因此为了提高聚焦效果，将第四步骤电压调整到10000 V.适合大豆花瓣双向电泳分析的等电聚焦程序如表2.

表2 适合大豆花瓣双向电泳分析的等电聚焦程序

2.5.4 SDS-PAGE

第二向在Ettan DALTsix GE Healthcare垂直板电泳仪上进行，SDS-PAGE凝胶终浓度(T)为12.5%，凝胶面积20 ×20 cm2，厚度1 mm。采用Laemmli 12%T分离胶浓度的系统，用0.5%低熔点琼脂糖密封液固定胶条，首先设置20 mA/gel的恒流条件，1 h后待溴酚蓝条带完全移入聚丙烯酰胺凝胶后调至40 mA/gel，至溴酚蓝前沿接近凝胶底部时电泳结束.由此确定大豆花瓣双向电泳分析中，第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳的程序和时间为 20 mA 1 h，40 mA 8 h.

2.5.5 染色

双向电泳分离蛋白质常规检测和定量的染色方法是考马斯亮蓝和硝酸银染色法，通过实验确定，满足一次双向电泳分析，采用银染显色，大豆花瓣蛋白上样量最少需要200 μg.采用胶体考染，蛋白上样量最需要250 μg.实验表明，考马斯亮蓝和质谱技术兼容性好，然而考马斯亮蓝染色的灵敏度要比银染低2～3个数量级;Oakley等的银染方法虽已被广泛使用，且灵敏度很高，但由于银染过程中醛类与缓冲液中的甘氨酸发生特异反应，影响后续的质谱操作，一些经过改进与质谱兼容的银染方法也由于质谱图噪音信号太强而影响鉴定结果.由于大豆花瓣小，蛋白质含量低，取样困难，因此在大豆花瓣的蛋白质组研究中我们选用银染方法进行2-DE凝胶的分析，而加大蛋白质样品上样量后，用考马斯亮蓝染色方法进行蛋白点切取以备质谱鉴定.

3 讨论

蛋白样品的制备是双向电泳技术最基础、最关键的环节，合理的样品制备是保证获得分辨率高和重复性好的双向电泳图谱的前提.这一处理的好坏直接影响到双向电泳的结果.大豆花瓣组织由于本身特有的成分，其蛋白质提取比动物、微生物及一些植物叶片更为复杂.除了采用优化的技术体系，在操作过程中还应尽量减少蛋白提取过程中的降解和丢失，以提高分辨率;为提高大豆花瓣高、低分子量全蛋白的抽提效率，应尽量简化样品处理步骤.

要得到大豆花瓣总蛋白，除对大豆花瓣组织细胞进行有效的破碎外，利用变性剂、表面活性剂、两性电解质、还原剂等成分可以实现蛋白质的有效裂解.本实验对两种裂解液进行对比分析，结果表明蛋白蛋白裂解液Ⅱ(含有尿素、硫脲、CHAPS及TCEP)的溶解性比裂解液Ⅰ(含有尿素、硫脲及CHAPS)更强，分辨率更高.可见由高浓度的尿素和硫脲以及SB3-10的联用，可以强烈破坏蛋白分子间形成的氢键，从而防止由氢键引起的蛋白质聚集及蛋白迁移中二级结构的形成.去污剂和表面活性剂CHAPS和SB3-10可以减少脂类污染.破坏蛋白之间的疏水性互作，增加疏水性蛋白的溶解.

因为大豆花瓣组织中的干扰成分较复杂，根据GE公司推荐的双向电泳聚焦参数及二向电泳参数，该实验对其进行优化，将低压除盐的时间加大了一倍，使其除盐充分，减少了双向电泳过程中因为一些盐离子及杂质的干扰而产生的横纵条纹.

4 结论

TCA/丙酮-2D Clean Up试剂盒法可初步解决大豆花瓣中多糖、脂类、色素等双向电泳严重干扰的问题;由5 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，2%SB3-10，5 mmol/L TCEP，20 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer配制的裂解液是一种高强度的有效的裂解大豆花瓣蛋白的裂解液;结合TCA/丙酮-2D Clean Up试剂盒法可以获得分辨率更高的双向电泳图谱;采用pH4-7范围的线性胶条，同时结合高伏时、长时间的等电聚焦可以获得高分辨率、重复性好的大豆花瓣蛋白质双向电泳图谱.

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Optimization of Two-Dimensional Gel Electrophoresis for Proteome of Soybean(Glycine Max L.Merril)Floret

Zheng Tianhui，Song Bo，Jiang Ziqin，Diao Guizhu，Zeng Rui，Wu Shuai，Tuo Yun，Liu Shanshan
(Northeast Agricultural University)

Protein extraction methods and electrophoresis conditions are the key of two dimensional electrophoresis technologies in proteomics research.A two dimensional electrophoresis technology system for soybean full flower protein is established.There are many pigments，phenol and other interfering substances in the soybean petals，so six protein extraction methods and two protein analysis buffer are compared to improve protein extraction methods，and the range of IPG strip and isoelectric focusing procedure are optimized.The results show that TCA/acetone+2 D Clean Up kit remove most impurities，yield the high protein content，good separation and short time-consuming;The analysis buffer containing 5 mol/L Urea，2 mol/L Thiourea，2%CHAPS，2%SB3-10，5 mmol/L TCEP，20 mmol/L DTT，0.5%IPG Buffer has good dissolving ability.Increasing the centrifugation speed，time，and the times of acetone washing can promote the dissolving of protein and increase protein purity.pH 4 ～7 IPG strip is suitable for separation of soybean full flower protein.A two dimensional electrophoresis proteome analysis technology system for soybean full flower proteins is established.

Soybean;Two dimensional electrophoresis;Technology system;Optimization

2010-09-28

*国家自然科学基金资助项目(31071440);黑龙江省普通高等学校青年骨干支持计划项目(1155G12);博士后研究人员落户黑龙江科研启动项目(2009HB009);转基因生物新品种培育重大专项子任务:抗病虫转基因大豆新品种培育资助项目(2008ZX08004-004)

＊＊通讯作者

(责任编辑:李佳云)