李亚玲 赵玉洁 谢风行 周 可 张峰峰

摘要:对一株产碱性蛋白酶假丝酵母菌(Candida sp.N9211)的发酵条件进行了优化,研究各种碳源、氮源及无机盐对产酶的影响,应用正交试验优化发酵培养基组成。结果表明:最佳培养基组成为酵母膏20 g/L,蛋白胨15 g/L,干酪素20 g/L,硫酸亚铁0.01 g/L。优化后蛋白酶活性提高了27倍(由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL)。摇瓶培养的最佳条件为:初始pH值10.0,接种量1%,发酵温度35 ℃,最佳培养时间为15 h。

关键词:碱性蛋白酶;酵母菌;产酶条件

中图分类号: Q93;TQ925文献标识码:B 文章编号:1006-6500(2009)01-0005-05

Optimization of Medium and Cultivation Conditions for Alkaline Protease Production by Candida sp.N9211

LI Ya-ling, ZHAO Yu-jie, XIE Feng-xing, ZHOU Ke, ZHANG Feng-feng

(Tianjin Reararch Center of Agriculture Biotechnology, Tianjin 300192, China)

Abstract:The culture of Candida sp.N9211 were optimized for the production of alkaline protease. The optimum medium (per liter) wasconsisted of 20 g yeast extract, 15 g peptone, 20 g casein, 0.01 g FeSO4. After optimization of the culture medium, the enzyme production in shake flasks was enhanced from 1.55 U/mL to 41.85 U/mL. The optimum fermentation conditions were determined as follows: initial pH 10.0, inoculation size 1%, temperature 35 ℃, and cultivation time 15 h.

Key words: alkaline protease; yeast; fermentation conditions

碱性蛋白酶是一类适宜于在碱性条件下(pH9～10左右)水解蛋白质肽键的酶类,是非常重要的工业用酶[1]。在我国,利用嗜碱性微生物生产碱性蛋白酶的研究还处于起步阶段。目前,蛋白酶主要来源于芽孢杆菌属[2,3]。生产菌株的单一性不但不能满足制革、丝绸、日化工业对多种酶类生产的需求[4],而且芽孢杆菌在工业生产过程中产生的芽孢往往影响产品的产量和质量[5]。另外,目前能专一识别特定氨基酸序列的蛋白酶还很少,从微生物中进行广泛筛选应该是寻找这类蛋白酶的途径之一[6]。因此,打破现有产酶菌种的局限性,积极开发新菌种势在必行。刘文斌[5]从黄石土壤中分离到一株毛状假单胞菌,酶活力为45.0 U/mL。梅承芳等[7]从碱湖中分离出一株产蛋白酶的弧菌,产酶能力为3 268 U/mL。池振明等[8]从海洋中分离出一株酵母菌,经培养条件优化后产蛋白酶能力为7.2 U/mL。王跃军[9]、李树军等[10]也先后发现了产蛋白酶的非芽孢杆菌菌株。这些研究都拓宽了我国产碱性蛋白酶的菌种资源,丰富了蛋白酶的种类。

目前,关于产碱性蛋白酶的酵母菌的报道甚少,本课题组在天津盐碱沼泽中筛选出一株酵母菌株(Candida sp.N9211),具有较高的产蛋白酶能力。本研究在此基础上以酵母菌株N9211为出发菌株,通过蛋白酶活性的变化对发酵培养基成分和发酵条件进行优化,使其产蛋白酶的能力提高了27倍,为有关酶的分离纯化、酶学性质研究及发酵工程菌构建奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 菌 种

酵母菌株Candida sp.N9211为本研究所筛选保藏菌种。

1.2 试 剂

干酪素、L-酪氨酸、三氯乙酸、无水碳酸钠、氢氧化钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、浓盐酸、浓溴水等各种化学式剂均为分析纯,购自天津科威试剂公司。

1.3培养基

种子培养基:YPD培养基,成分为2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母浸膏。

发酵培养基:根据需要,由种子培养基添加一定量的不同碳源或氮源物质及无机盐组成。

1.4培养方法

将保存的酵母菌种N9211接到种子培养基中,于30 ℃、180 r/min的条件下进行培养。对数生长期中后期的培养物作为种子液,以1%的接种量转接入100 mL/250 mL的三角瓶发酵培养基中,根据实验方案改变培养基及培养条件进行发酵条件试验。

1.5 酶液制备

取酵母培养液于4 ℃、5 000 r/min离心10 min,所得上清液用甘氨酸—氢氧化钠缓冲液(0.05 mol/L,pH9.0)进行适当稀释后得粗酶液。

1.6 分析方法

1.6.1 酶活的测定[11]在1 mL粗酶液中加入1 mL用甘氨酸—氢氧化钠缓冲液(0.05 mol/L,pH 9.0)配制的2%的酪蛋白溶液,40 ℃精确反应10 min后迅速加入2 mL10%的TCA溶液(三氯乙酸)终止反应。4 ℃、10 000 r/min离心10 min,取上清液1 mL,加入Folin酚试剂显色后于650 nm下测OD值。规定用1 mL酶液在40 ℃下水解1 mL质量分数为2%的酪蛋白10 min,以每分钟释放1 μg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

1.6.2 生物量测定取10 mL发酵液,离心分离菌体,用蒸馏水洗涤3次后收集菌体,80 ℃烘干至恒质量,即为发酵液中的生物量,以g/L计。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源对产酶的影响

分别以浓度为20 g/L的蔗糖、甘油、乳糖、可溶性淀粉和柠檬酸代替YPD培养基中的葡萄糖,以不加葡萄糖的YPD培养基作对照,灭菌后按1%的接种量将酵母菌种子液接入各培养基中,30 ℃,180 r/min进行过夜培养。培养液离心后Folin酚法测定酶活,考察不同碳源对菌体产酶的影响,结果见图1。由图1可知,去掉YPD培养基中的葡萄糖时菌体产酶水平显著提高,达到11.24 U/mL,比加葡萄糖的YPD培养基的1.55 U/mL提高了7.25倍。蔗糖、柠檬酸等其它糖类和有机酸作为碳源时酶活也比无糖培养基低,这说明糖类和有机酸对酵母菌产蛋白酶具有抑制作用,分析可能是一种分解代谢物阻遏现象。酵母膏和蛋白胨都是复杂的有机物,既可以提供氮源又可以提供碳源,因此,本试验选用酵母膏和蛋白胨作为酵母菌的碳源物质。

2.2 不同氮源对产酶的影响

氮源对酵母菌产蛋白酶的影响较大,解除了YPD培养基中葡萄糖的抑制作用,剩余的酵母膏和蛋白胨成分为酵母菌提供碳源的同时也提供了丰富的氮源。在酵母膏—蛋白胨培养基中分别添加20 g/L的柠檬酸铵、干酪素、硝酸钾、硝酸钠、尿素等各种氮源。结果如图2所示,添加干酪素的培养基中蛋白酶活性达到12.83 U/mL,比对照的11.67 U/mL提高了10%,干酪素对蛋白酶具有诱导产生的能力。硝酸钾、硝酸钠等无机氮源的产酶效果次之。对这几种氮源做方差分析,并进行多重比较,干酪素与其它几种氮源相比,有显著性差异,因此选用干酪素作为添加氮源。

2.3 无机盐对产酶的影响

碱性蛋白酶需要有金属离子的激活,必需的金属离子有Mn2+、Mg2+、Zn2+、Co2+、Fe2+等[12]。本试验在含有10 g酵母膏、20 g蛋白胨和10 g干酪素的培养基中分别加入0.01 g/L的硫酸锌、硫酸亚铁、三氯化铁和0.1 g/L的氯化钙、硫酸镁、氯化钾等无机盐成分,结果如图3。硫酸锌和硫酸亚铁对菌体产酶有促进作用。对这几种无机盐做方差分析可知,在培养基中加入硫酸亚铁对酶活影响较大,与其它几种无机盐相比有显著性差异;硫酸锌其次,氯化钙、三氯化铁和硫酸镁3种无机盐没有显著性差异,而氯化钾对菌体产酶表现出抑制作用。添加硫酸亚铁后蛋白酶活性由14.24 U/mL提高到28.91 U/mL,可见硫酸亚铁对酵母菌产蛋白酶具有显著影响。

2.4 培养基正交试验

根据上述试验结果,选择酵母膏、蛋白胨、干酪素和硫酸亚铁作为发酵培养基组成。为了研究培养基各成分对产酶的影响,设计了一个4因素3水平的正交表进行试验,正交试验结果与分析详见表1和图4。从表1可知,本试验所设的4个因素对产酶的影响顺序为:酵母膏(A)>蛋白胨(B)>FeSO4(D)>干酪素(C),说明酵母膏是影响产酶的主要因素,其次是蛋白胨、硫酸亚铁,干酪素影响最小。同时可知,以A因素的水平3,B因素的水平2,C因素的水平3和D因素的水平1的组合酶活性最高,即认为A3B2C3D1为最佳配比。由此得到发酵培养基的最佳配方为:酵母膏20 g/L,蛋白胨15 g/L,干酪素20 g/L,硫酸亚铁0.01 g/L。

2.5 不同温度对产酶的影响

由图5可知,20～30 ℃之间,随着温度的升高细胞代谢速度加快,菌体的酶活也随着提高,30～35 ℃时酶活达到最大值,而后随着温度的升高,酶活又迅速降低。

2.6 不同pH值对产酶的影响

pH值是影响细胞生长的一个很重要的因素,不同的嗜碱微生物的嗜碱能力不同,在不同的初始pH值下的生长繁殖能力和产碱性蛋白酶的能力都存在着一定的差异。将发酵液培养基调整至不同的pH值,对产酶的影响结果如图6所示,菌株N9211产蛋白酶的pH范围较宽,在pH6～12条件下酶活均在20 U/mL以上,在初始pH值为10时酶活力最高,达40.70 U/mL,这符合碱性蛋白酶菌株对碱性生长环境的需求。

2.7 菌株N9211代谢曲线的测定

菌株N9211代谢曲线的测定将有利于确定最佳发酵时间、pH值、产酶与菌体生长的关系,以及今后的发酵培养等等。在温度35 ℃、初始pH值10.0、接种量1%、转速180 r/min条件下,于接种后第3,6,9,12,15,18,21,24,27,30 h取发酵液,测定酶活、生物量和pH值,考察不同发酵时间下菌体生长与产酶的关系。由图7中pH值的变化可以看出,酵母菌N9211对生长环境中的pH值有一定的调节能力,基本趋势是体系pH值先降后升,后期稳定保持pH值8～9左右。嗜碱菌一般具有一个比外部环境低的细胞质pH值,尽管外部pH值较高,但细胞内细胞质pH值仍可维持在8.0左右。但关于酵母菌pH调节能力这方面的报道还较少,相关的机理也不是很清楚。可能在菌体生长繁殖期和产酶期对体系pH值具有不同的需要,导致了其自身的pH调节机制。图7表明,0～20 h酵母菌体大量生长,酶活也逐渐提高,15 h酶活达最大值,20 h以后酵母生长进入稳定期,酶的合成随着减弱。菌体生长与酶活变化并不完全同步,该酶生物合成类型属于半藕联合成型。从产酶过程可见,其培养较合适的时间为15 h。优化培养基和培养条件成效较显著,优化后的发酵液中酶活比未优化前有了显著提高,由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL。

3 结 论

以酶活性为考察指标,对酵母菌(Candida sp.N9211)产碱性蛋白酶的培养基和培养条件进行了优化,得到的最佳培养基组成为:酵母膏20 g/L、蛋白胨15 g/L、干酪素20 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L。摇瓶培养的最佳条件为:初始pH值10.0,接种量1%,发酵温度35 ℃,最佳培养时间为15 h。优化后蛋白酶活性由1.55 U/mL提高到41.85 U/mL,提高了27倍。本菌株不但拓宽了我国产酶的菌种资源,也丰富了蛋白酶的种类。菌株N9211的产酶能力高于池振明从海洋中分离的布鲁氏酵母[8],今后通过基因工程方法对其加以改造将有望进一步提高蛋白酶活力,为功能性酵母菌的开发和在食品、医药、饲料、环保等领域的广泛应用奠定基础。

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