赵严 吴建兵 潘立 张小雷 邱云平 苏明明 贾伟 王兴鹏

高脂血症性胰腺炎患者尿样的代谢组学

赵严 吴建兵 潘立 张小雷 邱云平 苏明明 贾伟 王兴鹏

目的基于气相色谱质谱的代谢组学分析方法，研究高脂血症性胰腺炎(HLP)患者尿样。通过对其尿样代谢物组的分析和生物标记物的发现，寻找HLP的代谢变化，探讨代谢组学在急性胰腺炎(AP)中的应用。方法取24例HLP患者尿样及40例年龄、性别匹配的正常健康人尿样，样品经预处理、衍生和气相色谱质谱分析后，利用正交偏最小方差判别分析(OPLSA-DA)的方法，观察健康组和HLP组的代谢轮廓差异。结果上述方法能清晰地将HLP患者和健康人样本分开，通过NIST、Wiley等谱库搜索分析了21个代谢物(可信度gt;700)。其中用标准品鉴定之后，发现与健康组比较HLP患者尿样中烟酸、乌头酸、柠檬酸、马尿酸、对-羟基苯乙酸、对-羟基苯丙酸含量下降；色氨酸、酪氨酸、酪胺、棕榈油脂、硬脂酸等物质含量上升。代谢组学研究显示HLP患者三羧酸循环、肠道菌群结构、脂肪代谢及氨基酸代谢等发生改变。结论HLP患者和正常人尿样代谢谱之间存在差异，而且可能从代谢组学分析中找出特异的标志性代谢产物，阐释该疾病的代谢变化；表明利用代谢组学研究尿液中的代谢物，可以为HLP的诊断和发病机制提供一个可借鉴的手段；代谢组学分析是一种有良好发展前景的研究方法。

代谢组学； 气相色谱质谱法； 高脂血症性胰腺炎； 尿液； 生物标记物

在我国，由于近十几年来饮食结构的改变和对高脂血症认识的加强，高脂血症性胰腺炎(hyperlipidemic pancreatitis，HLP)已经成为急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)的常见病因之一。代谢组学主要研究生物对外源性物质所引起的病理生理反应，以及对遗传变异的应答和内源性代谢物的动态变化，通过对生物体液和组织中随时间改变的代谢物进行检测、确定、定量和分类，将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来，以监测活细胞中的化学变化。本课题组采集HLP患者和健康人尿样，运用代谢组学技术分析HLP患者尿中代谢物的共性，以期发现生物标记物，探索HLP诊断和治疗的新方法与新途径。

材料与方法

一、研究对象

收集2006年10月至2008年3月在山西医科大学附属第一医院及上海交通大学医学院附属第一人民医院收治的24例HLP患者，并从各自医院体检中心选择与患者年龄、性别等因素相匹配的健康人样本进行比较。HLP的诊断标准是：(1)具有AP的临床表现，符合中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组制定的标准[1]；(2)入院时(治疗前)的血TG≥11．3 mmol/L，或TG在5.6～11.3 mmol/L，但血清呈脂浊者；(3)排除胆道疾患、酗酒、药物、肿瘤、外伤等病因。

二、尿液气相色谱-质谱(GC/MC)分析

所有患者以及正常人均签署同意书，详细说明本研究的目的和方法。样本收集前一天要求食用清淡饮食，避免海鲜以及辛辣食物，并禁止饮酒与吸烟，以减少食物对代谢造成的波动。

留取晨起第一次尿液，分装eppendorf管，置-80℃保存。试验前1 h取出尿液样品，室温下解冻摇匀，10 000离心10 min，取上清按文献[2]的方法进行氯甲酸乙酯(ECF)衍生化处理。操作步骤为：吸取离心后的尿液上清600 μl于具塞玻璃试管，加入内标物0.1 mg/ml氯苯丙氨酸100 μl混匀；再加无水乙醇400 μl、吡啶100 μl以及ECF 50 μl,震荡混匀10 s，超声反应1 min；反应后加入氯仿300 μl，漩涡震荡30 s，以3 000 rpm离心3 min；加7 mol/L NaOH 100 μl调节水层pH至9～10，再加ECF 50 μl，振荡10 s,超声反应1 min；振荡混匀30 s,3 000 rpm离心10 min；弃水层，氯仿层加入少量无水硫酸钠，上GC/MC联用仪(AutoSystem XL Gas Chromato-gram/TurboMass Mass Spectrometer，Agilent 6890，USA)分析，采用的石英毛细管色谱柱为DB-5MS (5% Diphenyl cross-linked 95% dimethy-lpolysi-loxane:30 m×250 μm i.d.,0.25 μm;Agilent Jamp;W Scientific,Folsom,CA)。

尿样GC/MS分析条件：(1)不分流进样。进样量1 μl。进样口温度260℃，离子源温度200℃，接口温度220℃。载气为氦气，载气流速1 ml/min。升温程序为80℃，0～2 min；以10℃/min速度升至140℃，维持2～8 min；以4℃/min速度升至240℃，维持10～35 min；以10℃/min速度升至280℃，维持36～40 min;再保持40～43 min。(2)质谱条件为溶剂延时3 min；电离方式EI；电子能量70eV;质谱扫描范围：m/z30～550;采用全扫描方式。

三、统计学分析

先用非监督主成分分析(PCA)用来总体考察正常人和HLP患者尿样中总体代谢模式的差别，然后采用有监督的正交偏最小方差判别分析(OPLS-DA)的多维统计方法来鉴别用于区分各组别间代谢轮廓贡献较大的代谢物。多维统计中找到的差异代谢物需要进行单维验证的方法对多维的结果进行验证。

对差异代谢物使用NIST、Wiley、NBS和上海交通大学药学院系统生物医学试验室建立的ECF标准品数据库进行结构鉴定。

结 果

一、尿样分析的总离子流图和OPLS-DA模型

健康人和HLP患者尿液经GC/MS分析得到的总离子流图(TIC)见图1。

采用OPLS-DA的方法对两组样本建模。将Y值设定为0/1的矩阵(健康人设为0，HLP患者设为1)，可以将正常人与HLP患者完全分开，获得良好的区分模型(图2)。

图1HLP患者(红色)和健康人(绿色)尿样的总离子流色谱图

图2 HLP患者和正常健康人尿样的OPLS-DA分析图

二、差异代谢物的分析

本试验共发现142个差异代谢物，其中可信度gt;700有21个代谢物(表1)。HLP患者较健康人升高的代谢物有15个，降低的有6个。对这些物质进行生化解释，它们与三羧酸循环、肠道菌群的结构改变等相关。

表1 HLP患者与健康人尿样间的差异代谢物

讨 论

目前认为，高脂血症是继胆源性和酒精性之后AP的常见原因。高脂血症引发AP的发病机制复杂，预后差，复发率高，有重症化倾向。代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。通过考察生物体受刺激或扰动后其代谢产物随时间的变化来研究生物体代谢途径的一种技术。主要检测手段是磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、质谱(mass spectrometry, MS)等。通过检测一系列样品的峰谱，再结合模式识别方法，可以判断生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物。

近年来研究认为，肠道菌群在宿主的营养、代谢以及保护宿主免受外界侵袭等方面起着重要的作用。很多疾病的发生、发展也与肠道菌群结构的变化密切相关[4]。AP时的肠道菌群易位[5]和肠源性内毒素血症构成对机体的第二次打击，导致胰腺组织继发感染和炎症递质级联反应。大量细菌学研究表明[6]，AP的继发感染为肠道菌群移行所致。重症急性胰腺炎时肠道内需氧的革兰阳性肠球菌与革兰阴性肠杆菌的数量显著增加，使内毒素生成增加，肠道成为巨大的毒素池；而肠道内专性厌氧的双歧杆菌、乳酸杆菌和类杆菌数量明显下降，导致肠道菌群失调。本试验采用GC/MS的方法测定健康人、HLP患者尿样的代谢物，发现了21个差异物质构成的代谢物谱，一些含苯基的代谢物，包括马尿酸、苯乙酸、对羟基苯乙酸、对羟基苯丙酸等在HLP患者中发生了紊乱。这些代谢产物主要是肠道菌群对酚类物质代谢产生的，表明肠道菌群结构在HLP发病过程中的改变。

本试验还发现一些三羧酸循环的中间代谢物，如柠檬酸、乌头酸的含量在HLP患者尿样中降低，表明HLP患者发病过程中其有氧能量代谢通路受到抑制。三羧酸循环的主要代谢酶存在于亚细胞器线粒体中。目前已知线粒体功能异常与心脑血管、糖尿病、肿瘤、神经退行性病等相关，它与HLP的发病关系需要进一步探讨。

棕榈油脂、硬脂酸是2种长链不饱和脂肪酸代谢产物，在HLP患者中亦有明显升高，过多的游离FFA可引起胰腺细胞内Ca2+升高[7]，诱发内质网应激，从而引起细胞凋亡，加重胰腺腺泡细胞的损害[8]，导致HLP发生。进一步证实游离脂肪酸对胰腺腺泡细胞存在的损伤作用。

综上所述，对HLP患者尿液进行气相色谱质谱的代谢组学分析，显示三羧酸循环、肠道菌群结构、脂肪代谢、氨基酸代谢、线粒体功能等发生改变，从另一角度阐释该疾病的生物学本质。

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2008-08-04)

(本文编辑：吕芳萍)

Metabonomicsstudyofurinesamplesofpatientswithhyperlipidemicpancreatitis

ZHAOYan,WUJian-bing,PANLi,ZHANGXiao-lei,QIUYun-ping,SUMing-ming,JIAWei,WANGXing-peng.

DepartmentofGastroenterology,ShanghaiFirstPeople′sHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China

ObjectiveMetabonomics method based gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) were used to analyze the urine samples of patients with hyperlipidemic pancreatitis (HLP) to describe the characteristics of metabolism changes of HLP, identify potential biomarkers, and investigate the role of metabonomics study in the management of AP.Methods24 patients of HLP and 40 age, sex matched volunteers were enrolled and their urine samples were collected. The urine samples underwent preparation, derivation and GC/MS analysis, Orthogonal-Projection to Latent Structures-Discriminant Analysis (OPLS-DA) were performed to detect the metabolic profile difference between the HLP and control group.ResultsHLP patients can be precisely distinguished from healthy controls. 21 metabolites (credibility gt;700) were identified using the reference compounds available in the libraries of NIST and Wiley. It was identified that levels of nicotinic acid, aconitic acid, citric acid, hippuric acid, hydroxyphenylacetic acid, hydroxyphenyl-propionicacid were decreased, while the levels of tryptophan, tyrosine, tyramine,16-hexadecanoic acid,18-octadecanoic acid were increased. It was also suggested that there was change in tricarboxylic acid cycle and gut bacterial flora, as well as fat metabolism and metabolism of amino acid.ConclusionsThere are differences between healthy controls and HLP patients in the term of GC/MS metabolic profiling, and the biomarkers in the metabolites could be found through metabonomics analysis, and the mechanisms of the metabolic changes could be explored. It was noted that the research of metabolites in the urine samples may be a useful tool to help diagnose and understand the pathogenesis of HLP. Metabonomics analysis is a promising research method.

Metabonomics; Gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS); Hyperlipidemic pancreatitis(HLP); Urine; Biomarker

Correspongdingauthor:WANGXing-peng,Email:wangxp1965@yahoo.com.cn;JIAWei,Email:weijia@sjtu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.004

山西医科大学青年基金(02200702)

200080 上海，上海交通大学医学院附属第一人民医院消化科(赵严、张小雷)；山西医科大学第一医院消化科(赵严)；同济大学医学院附属第十人民医院消化科(王兴鹏)；上海中医药大学(吴建兵、张小雷)；上海交通大学药学院(潘立、邱云平、苏明明、贾伟)

王兴鹏，Email:wangxp1965@yahoo.com；贾伟，Email:weijia@sjtu.edu.cn