何方洋　罗晓琴　李　静

摘要酶联免疫吸附法(ELISA)是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合发展建立的一种免疫分析技术。不仅具有操作简便、快速、灵敏等优点,而且准确性好、特异性强、检测成本低,还可用于大批量样品的检测。从药物残留、生物毒素、微生物以及转基因食品安全性等方面,对该技术在食品安全检测中的应用进行了综述,并提出了存在的问题及相应的解决办法。

关键词酶联免疫吸附法;食品安全;药物残留;应用

中图分类号 TS201.6 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)15-0353-02

食品安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题,作为WTO的新成员,我国与世界各国间的贸易往来日益增加,食品安全已经成为影响农业和食品工业竞争力的关键因素,并在某种程度上制约了我国农业产业结构和食品工业的战略性调整。目前,全球食品安全形势不容乐观,主要表现为食源性疾病、恶性食品污染不断上升和部分食品生产加工新技术与新工艺带来新的危害,给人体健康带来了长期和严重的潜在健康危害。但对于目前一些公认的重要食源性危害,在检测技术方面,不少尚属空白或不够完善,不能满足食品安全控制的需要。因此,建立一项高技术化、系列化、速测化、便携化的检测方法显得特别重要。酶联免疫吸附剂测定技术,即ELISA,因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性,在食品安全与药物残留等的安全性检测领域中有着广泛的发展前景。

1酶联免疫分析法概述

1.1基本原理

酶联免疫分析法的基本原理是把抗原或抗体预先结合到某种固相载体表面;测定时,将受检样品(含待测抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物;反应终止后,固相载体上酶标抗原或抗体被结合量(免疫复合物)与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例;经洗涤去除反应液中其他物质,加入酶反应底物后,底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物,最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。

1.2与其他检测法相比的优势

目前用于食品安全检测的方法有很多,如薄层色谱(TLC)、微生物法、气相色谱(GC)、质谱(MS)、高效液相色谱(HPLC)和核酸探针技术等。但这些方法有的必须进行较为复杂的样品预处理,有的不能定量且灵敏度低,有的虽灵敏度高,但设备昂贵,检测费用高,难以推广使用。微生物法不易筛选到特别敏感的菌株,也只能定性不能定量,易受其他抗菌药物的影响;核酸探针则在试验过程中易受到污染。而酶联免疫分析法不仅灵敏度高、干扰小、安全性高、污染少、检测通量大,且操作简便快捷。

2ELISA技术在食品安全性检测中的应用现状

2.1农药残留检测

近年来滥用农药现象使农药残留量超标相当严重,并逐年加剧。传统的农药残留检测方法如气相色谱法和高效液相色谱法能精确地检测残留的农药量,但需要昂贵的仪器设备、复杂的前处理、专业技术人员及较长的分析周期。20世纪80年代开始,农药的免疫检测技术作为快速筛选检测方法得到了快速发展。目前几乎所有农药类别都建立了酶联免疫分析方法,检测样本以农产品、食品、饲料和环境为主。欧洲、美国、日本、巴西等多个国家应用该技术对农产品中有毒物质残留进行生物技术监测研究,粗筛检测水产品、肉类产品和果蔬产品中农药残留量。最近,英国研制的通用型有机磷杀虫剂免疫检测试剂盒可同时检测8种以上的有机磷农药[1]。我国在近10年来也相继开展了农药残留酶免疫法快速检测方法的研究,取得了一定的研究成果,如山东京蓬生物药业公司在乙酰胆碱酯酶基础上开发研制的快速检测试纸,对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测快速而准确,敏感度0.01～5.00mg/kg,准确率达90%以上。

2.2动物性食品中药物残留检测

近年来动物性食品药物残留问题更加突出。目前,国内应用ELISA技术检测药物残留研究取得较大进展。王伊琴等[2]建立了氯霉素残留检测的ELISA方法,灵敏度0.025～2.000ng/mL,检测限0.02μg/kg,回收率达78.2%。王自良等[3]研制的苯巴比妥ELISA试剂盒,线性检测范围达1.0~81.0ng/mL,灵敏度0.75ng/mL,检测限1ng/mL,在饲料样和猪尿样的平均添加回收率分别为85.8%和91.3%。王选年等[4]研制的盐酸克伦特罗ELISA试剂盒线性检测范围为0.5~128.0ng/mL,与肾上腺素、去甲肾上腺素、莱克多巴胺及多种抗生素均无交叉反应性,回收率高达90%以上。

2.3生物毒素的检测

Anna Yu Kolosova等[5]运用ELISA方法测黄曲霉毒素B1,检测范围0.1~10.0ng/mL,IC500.62ng/mL,大米样品中的回收率为94%～113%。近十几年来国内用于生物毒素检测的ELISA方法得到迅速发展,已有多种ELISA诊断试剂盒用于分析不同的毒素。湖北省农科院研制的黄曲霉毒素ELISA试剂盒,在检测食品、饲料中的黄曲霉毒素时,抗原转化率为89.4%,检测限3.33ng/mL;王玉平等[6]在抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体基础上,研制出ELISA定量检测试剂盒,灵敏度1 ng/mL,检测限10ng/g,该方法也被广泛应用于各种藻类和贝类毒素的检测。

2.4微生物的检测

食品安全问题中,首要问题是微生物污染。检测微生物的方法很多,常规的微生物学检验方法试剂繁杂、检验周期长,远不能适应实际需要,而ELISA法很好地弥补了这一缺陷。用ELISA法可检测食品中沙门氏菌、大肠杆菌等微生物,其中通过制备单克隆抗体分析食品中细菌的ELISA技术研究最多,检测结果准确可靠。Lyer MS等[7]用间接ELISA法来测食品和饲料中的镰刀菌,可检测出102～103cfu/mL的含量;文其乙等[8]建立了直接ELISA法检测沙门氏菌,能检出沙门氏菌属99个菌株,最低检测量可达500cfu/g,时间仅需22h,比常规方法缩短了3~4d,与其他肠道杆菌不发生交叉反应。

2.5转基因食品安全性的检测

转基因过程的每一个环境都有可能对食品的安全性产生影响,因此转基因食品的安全性是最近有关食品安全性研讨的热点问题之一,许多国家都有严格的法规来管理转基因食品。ELISA主要应用于原料和半成品的快速定性分析[9],因而解决了转基因样品检测中核酸制备困难的问题。Rogan等用ELISA技术检测出传统大豆加工产品中混有2% Roundup Ready大豆中的CP4 EPSPS蛋白质。此方法具有选择性和灵敏性,具有商业可利用性。Holzhauser等[10]运用ELISA技术检测出各种食物中花生蛋白质的最低残余量为2mg/kg。目前,市场上已有检测常见转基因蛋白的ELISA试剂盒。如Stratejic Dignostics公司已开发能简便地定性检测转基因大豆的试剂盒,其原理就是利用ELISA方法制备出的特异性抗体检测Roundup大豆的特异基因产物CP4 EPSPS蛋白。

3ELISA技术在食品安全性检测中的研究展望

酶联免疫技术研究虽然只有短短几十年,但它可以应用到检测的各个领域,也为医学、分子生物学领域的应用展示了广阔的前景。国内外有许多家公司制作了大量的ELISA商业试剂盒。但我国现行的食品安全检验还没有规范化,体现在:检测方法多借鉴或参照国外的一些方法,不完整,没能形成体系;可比性、可操作性较差;检测方法繁琐、报告结果周期长,不适应日常大量的生产流通环节对产品质量的临控;检测灵敏度无法达到国际上现行的、越来越严格的标准。酶联免疫吸附法因其简便、快速、灵敏、微量化等诸多的优点,在建立安全检验方法方面有很大的应用空间。现在,有大量的ELISA 商业试剂盒,可供作相应项目的检测,但由于食品原料体系的多样性、复杂性,ELISA法要成为某一食品安全检验的标准方法,并将其推广应用,还有一定距离。在改进样品的纯化步骤,提高回收率、灵敏度方面;在减少基底干扰,提高重现性和稳定性方面;在简化分析程序,降低分析成本方面;在与其他理化分析方法联用,克服自身局限性方面;在试剂、操作规程的标准化等方面有待于进一步摸索,还有大量工作要做。目前许多学者正致力于改进完善这种技术,不断有新的研究成果推出,可以肯定,ELISA在各种产品安全检测领域有着广阔的应用前景。

4参考文献

[1] CARSTEN JAHN,WOLFGANG SCHWACK.Determination of cutinound residues of chlorothalonil by immunoassay[J].Agr Food Chem,2001, 49(3):12-33.

[2] 王伊琴,包勇敢,胡烈山.ELISA在检测动物组织氯霉素残留中的应用[J].中国农学通报,2006,22(4):26-29.

[3] 王自良,王建华,杨艳艳,等.苯巴比妥残留快速检测阻断ELISA试剂盒的研制及性能测定[J].中国兽医杂志,2006,42(4):62-64.

[4] 王选年,杨艳艳,邢广旭.盐酸克伦特罗单抗快速检测试剂盒的研制[J].中国兽医学报,2004,24(1):75-78.

[5] KOLOSOVA,A Y,SHIM,W B,YANG,Z Y,et,al.Direct competitive ELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin B1. Stabilization of ELISA kit components and application to grain samples[J].Anal Bioanal Chem,2006(1):286-294.

[6] 王玉平,计融,江涛.玉米赤霉烯酮ELISA定量检测试剂盒研制[J].卫生研究,2006,35 (2):221-224.

[7] IYERM S,COUSIN M A.Immunological Detection of Fusarium Species in aModel Food System [C].2002 IFT AnnualMeeting,USA,2002.

[8] 文其乙,焦新安,刘秀梵.沙门氏菌快速检测试剂盒的研制及其应用[J].江苏农学院学报,1996,17(2):29-33.

[9] 崔林开,叶华智.3种ELISA法检测Bt杀虫蛋白的比较研究[J].安徽农业科学,2005,33 (11):2056-2057.

[10] HOLZHAUSER T,VIETHS S.Indirect competitive ELISA for determin ation of traces of peanut(Arachis hypogaea L.)protein in complex food matrices[J]. J Agric Food Chem,1999,47(2):603-611.