罗晓琴　张春叶

摘要阿维菌素类药物作为一种抗寄生虫药物,近年来在农业和畜牧业生产中得到广泛应用。就国内外有关AVMs残留检测方法作一综述,为更加深入、全面地了解动物性食品中AVMs残留研究奠定基础,同时为开展AVMs残留检测提供参考。

关键词阿维菌素;药物残留;检测方法

中图分类号S851.34+7.109文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)15-0334-02

寄生虫病是家畜常见的、危害严重的疾病之一,阿维菌素类药物(Avermectins,AVMs)的开发,开辟了寄生虫药物的新里程碑,使抗蠕虫药物作用剂量由mg/kg级下降到μg/kg级。AVMs对线虫和体外节肢动物有较强的驱杀作用,为农作物保护、动物和人类健康做出了重大贡献 [1-3]。但是,AVMs作为脂溶性药物,在动物体内的残效时间较长[4],因此按世界卫生组织(WHO)5级分类标准,仍将其列为高毒化合物。阿维菌素类药物有阿维菌素、伊维菌素、埃普利诺菌素、多拉菌素(DOR)、莫西菌素、塞拉菌素和甲胺基阿维菌素等药物[5,6]。

目前随着人们对畜禽产品质量要求越来越严格,几乎每个国家对食品中兽药残留都有相关的限量规定。因此,动物组织中AVMs残留成为兽药残留研究领域重点监控对象之一,残留检测方法显得极其重要。目前,关于AVMs在动物性食品中的单残留和多残留检测方法,国外报道相对较多一些,国内报道很少。

1国内外检测方法研究进展

1.1薄层色谱法(TLC)

Malanikova等曾使用TLC法检测阿维菌素,在硅胶薄层板上涂上荧光指示剂,用于样品检测。但TLC与高效液相色谱法相比较,灵敏度较低(1 000×10-9),一般只作定性分析,很少用于残留检测[7]。

1.2液相色谱-紫外检测方法(HPLC-UV)

根据阿维菌素类药物的共轭二烯结构在λ=240~250nm处有强烈的紫外吸收,建立起液相色谱-紫外检测方法,一般采用反相液相色谱法[8,9]。由于阿维菌素类药物在体内的最小有效浓度很低,而紫外检测器对阿维菌素类药物的最低检测限为1~2ng/mL[10],很难检出。而且,紫外检测器检测选择性不高,关于AVMs的UV测定法并不适合AVMs的残留分析[11],HPLC-UV法多用于制剂中阿维菌素类药物的检测,而很少用于实际样品集体残留检测。

1.3液相色谱-荧光检测方法(HPLC-FLD)

与紫外检测器相比,荧光检测器更灵敏,高约100倍,对样品量很少或浓度非常低的痕量分析特别适用。由于许多物质不发射荧光,只有那些具有对称共轭和非强离子化的化合物才能发射荧光,因此HPLC-FLD检测法受基体干扰少。与HPLC-UV比较,此方法大大提高了检测限,如在血浆中的AVMs检测限已达到0.02ng/mL[12]。然而由于AVMs本身没有对称共轭结构,不能直接用荧光检测器检测,而只有经荧光衍生化后,生成具有对称共轭的苯环结构才能发射荧光。

1.4液相色谱-质谱检测方法(HPLC-MS)

阿维菌素类药物残留检测的确证方法也得到了发展:HPLC-MS法检测灵敏度高,能方便地对痕量兽药多残留组分进行检测,同时能对兽药残留组分进行结构确证,因而极可能成为AVMs多组分残留确证检测的最佳方法之一。Howells和Saner以大气压化学电离-质谱(APCI/MS)方法测定了AVMs、IVM、EP、DOR 和MOX残留,定量限分别为3.1ng/g、3.2ng/g、2.2ng/g、4.0ng/g和3.2ng/g[13]。Gia-nell等以电子轰击离子化-质谱(EI/MS)方法检测了IVM残留[14]。

1.5液相色谱-质谱-质谱联用技术(LC3/MS3/MS)

LC3/MS3/MS法在液质联用法的基础上再进行质谱串联,能同时检测更多种药物,减少了工作量。Sheridan1R等[15]研究报道了牛奶中5种AVMs驱虫剂,即伊维菌素、阿维菌素、依立菌素、莫西菌素和米尔倍霉素的多残留检测方法,此方法使用简单的液液萃取,后用液相色谱-质谱-质谱联用技术(LC-MS-MS)进行定性、定量分离检测。

1.6在线超临界流体净化技术(SF3/HPLC3/FLD)

用于AVMs的多残留检测方法,在线SF3/HPLC3/FLD主要优点在于实现分离分析自动化,能定量地将萃取物转入分析系统,灵敏度高,适于痕量组分的分析。Danaher等建立了动物肝脏中阿维菌素、伊维菌素、依立菌素和多拉菌素多残留的超临界流体净化方法。

1.7免疫亲和色谱技术(immunoaffinity chromatography,IAC)

以免疫结合反应为基础的柱色谱技术,其原理是将抗体与惰性基质偶联制成免疫吸附剂,装柱。当待测组分流经IAC 柱时,抗原与相应抗体选择性结合,其余杂质则流出IAC 柱。再用适宜的洗脱溶剂将抗原洗脱,使样品得到有效分离、净化和浓缩。其操作方式有分批法和柱色谱法2种,并且IAC柱再生处理后可重复使用。MIAC(multi-immunoaffinity)和高效亲和色谱(HPIAC)是其发展方向。

1.8酶联免疫法(ELISA)

酶联免疫法(ELISA)是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。由于阿维菌素类药物是半抗原,不能刺激机体产生抗体,需与大分子载体物质(如蛋白质)相结合制备人工抗原,使其具有免疫源性,免疫动物产生特异性的抗体,然后建立免疫竞争法。此方法简单、快速,且不需要昂贵的仪器设备,适合于大批量样品筛选,便于推广。ShiW等[16]研究报道了牛肝组织中阿维菌素、伊维菌素、依立菌素的多残留检测间接竞争ELISA。筛选具有对AVMs最高抗体滴度的血清作为间接竞争ELISA反应,此血清与阿维菌素的交叉反应率为100%,与依立菌素的交叉反应率为145.4%,与伊维菌素的交叉反应率为25%。此方法的定量检测限为1.06ng/mL。

2前景展望

综上所述,各种检测方法均有其优势和相对的不足之处。由于阿维菌素类药物临床使用剂量小,分子量大,极难气化,无法使用气相色谱(gas chromatography,GC)检测,而薄层色谱法检测限高,不够灵敏,达不到残留分析的要求。高效液相色谱法(HPLC)灵敏度高,检测限能够低于最高残留限量(MRL),方法稳定、精确度高、特异性强,但是存在样品前处理复杂、需要专业的操作人员、花费较高等不足之处。液质联用法(LC-MS-MS)由于结合了质谱技术,检测灵敏度可以达到纳克、皮克水平,因此常用于确证分析,尤其是在国外应用较多,但由于其检测成本较高,在国内推广应用受到限制。

相比之下,酶联免疫分析(ELISA)法不仅避免了HPLC法样品前处理复杂和耗时、单个样本检测成本高等缺点,还具有灵敏度较高、特异性强、适用于大量样品的快速筛选等优点。因此,免疫学检测方法在基层大规模筛选检测中有广泛的应用前景。

3参考文献

[1] 沈建忠,谢联金.兽医药理学[M].北京:中国农业大学出版社,2003.

[2] 李俊锁,邱月明.兽药残留分析[M].上海:上海科学技术出版社,2002.

[3] 扈洪波,朱蓓蕾,李俊锁.阿维菌素类药物的研究进展[J].畜牧兽医学报,2000(6):520-529.

[4] MARRINER S E,MCKINNON I,BEGAN L A.The pharmacokinetics of ivermectin after oral and subcutaneous administration to sheep and horses[J].Vet Phar and Ther,1987(10):175-176.

[5] EGERTOU J E.Avermectins,a new family of potent antelmintic agents:efficacy of the Bla compent[J].Antimicrob,Agents Chernother,1979(15):372-378.

[6] TAKAHASHI Y,MATSUMOTO A,SEINO A,et a1.Streptomyces avermectinius sp.nov.an avermectin producing strain[J].Int J Syst Evol Microbiol,2002,52(6):2163-2168.

[7] 陈静,罗永煌.阿维菌素类药物在动物性食品中的残留检测研究概况[J].贵州畜牧兽医,2007(4):9-11.

[8] REUVERS T,DIAZ R,DE POZUELO M M,et al.Rapid screening method for ivermectin residue detection in cattle muscle and liver by liquid chromatography with UV detection[J].Anal Chim Acta,1993(275):353-358.

[9] BERNAL J L,DEL NOZAL M J,SALAS M,et al.HPLC determination of residual ivermectin in cattle dung following subcutaneous injection[J].Liq Chromatogr,1994(17):2429-2444.

[10] 李俊锁,钱传范.牛组织中阿维菌素残留的ELISA研究[J].畜牧兽医学报,1997,28(1):77-83.

[11] DEGROODT J M,DE BUKANSKI B W,SREBMIK S,et al.Deter-mination of ivermectin residues in meat and liver by HPLC and fluo-rometric detection[J].Liq.Chromatogr,1994(17):1419-1420.

[12] MONTIGNY P,SHIM J S K,PIVNICHNY J V.Liquid chromatog-raphic determination of ivermectin in animal plasma with trifluoroacetic anhydride and N-methylimidazole as the derivatization reagent[J].J Pharm Biomed Anal,1990(8):507-511.

[13] HOWELLS L,SANER M J. Multi-residue analysis of avermectins and moxidectin by ion-trap LC-MS[J].Analyst,2001(126):155-160.

[14] GIANELL L,MELLERIO G G,SIVIERO E,et al. Mass spectrometry of avermectins:structural determination of two derivatives ivermectin Bla.Rapid commun[J].Mass Spectrom,2000(14):1260-1265.

[15] SHERDAN R,DESJARDINS L. Determination of abamectin,dora-mectin,emamectin,Eprinomectin and moxidectin in milk by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J].J AOAC Int, 2006, 89(4):1088-1094.

[16] SHIW,HE J,JIANG H,et al,Determination of multiresidue of aver-mectin in bovine liver by an indirect competitive EL ISA[J].Agric Food Chem,2006,54(17):6143-6146.