张东旭　张　洁　张学兵　董国兴

摘要通过不同培养基、不同激素及添加物对蝴蝶兰各培养再生途径的影响进行了概述,为蝴蝶兰的组培技术研究提供参考。

关键词蝴蝶兰;组织培养;研究进展

中图分类号 Q943.1;S682.31 文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)15-0191-03

蝴蝶兰(Phalaenopsis)属热带或亚热带的兰科植物,深受人们的喜爱,研究和开发蝴蝶兰的组织培养具有重要的意义[1]。组织培养是蝴蝶兰快速繁殖的有效方式,目前主要有3条途径:一是利用蝴蝶兰杂交种子在无菌条件下诱导发芽,获得再生植株[2];二是从离体器官诱导产生原球茎(Protocorm like-body,以下简称PLB),通过原球茎的增殖、分化获得再生植株,即原球茎再生途径[3,4];三是通过离体器官诱导产生丛生芽,通过培养丛生芽获得再生植株,即器官再生途径[4-7]。

1无菌播种再生途径

蝴蝶兰经人工授粉可获得种子,但种子个体极其微小,结构简单,没有胚乳,只有1层极薄的种皮,通常在自然状态下很难萌发,需经组织培养无菌播种才能获得植株。在蝴蝶兰开花时选择优良植株进行自交或杂交授粉,生长4～6个月后尚未开裂的蒴果可用于试管无菌播种。由于蒴果内种子数量达几千万之多,1个蒴果便可繁殖出成千上万的植株[8]。通过无菌播种人工培养,能够在短期内获得大量幼小植株,是现阶段经济有效的快速繁殖方法,也是工厂化育苗的重要途径。种子无菌播种10d后胚明显膨大,呈鹅黄色,陆续变成绿色,约1个月的时间形成原球茎)。随后,原球体拉长,同时原球体上伴随着长出白色根毛状物,接着在顶端生长点处长出芽鞘,芽鞘不断长大,形成第1片鞘叶。至2个月时,于第1片鞘叶对面长出第2片鞘叶,随着鞘叶的生长,2～3个月的时间在2片鞘叶之间长出真叶。最后,转移到新的培养基上形成再生植株[8-10]。

魏翠华等[9]研究发现,添加香蕉汁对蝴蝶兰种子发芽、原球体形成以及叶片的生长具有促进作用,水解乳蛋白对种子萌发有抑制作用,比较光照和黑暗2种培养条件,种子萌发无明显差异。章玉平等[10]研究表明,外源植物生长调节剂对种子萌发有抑制作用,天然物质如苹果汁、香蕉汁、胰蛋白胨和活性炭对种子萌发具有促进作用。不同杂交组合的亲本基因型亲和力不同,对种子播种的发芽率和生长发育状况有很大影响[9]。魏翠华等[9]认为在培养过程中种子发芽的速度与接种到培养瓶中的微滴浓度有关,浓度高的,所含种子量多,水量少,发芽就快些,显示出发芽的“群体效应”。

在种子培养过程中用的培养基主要有KC[10]、1/2MS[10]、MS[11]、Kyoto[11]和VW[12]培养基等。张晓申等[13]研究表明,改良的KC培养基中种子发芽率高达91.2%,周俊辉等[14]认为改良KC培养基处理蝴蝶兰种子后生长出原球茎的增殖速度最快、长势最强。通过杂交种子无菌培养能在短时间内获得大量的再生植株,但由于蝴蝶兰种子苗是一种杂交品系,因此后代变异率高,除了少数自花系列较稳定以外,难以形成品质均一的大规模栽培品种。

2原球茎(PLB)再生途径

1974年,Intuwong等利用蝴蝶兰茎尖诱导出原球茎(PLB),再由原球茎(PLB)分化成幼苗,最后形成完整的再生植株,从而成为蝴蝶兰种苗生产最有效的方式之一[15]。

大量的研究结果表明,诱导蝴蝶兰原球茎采用的外植体主要有茎尖[3]、根段[16]、花梗苗根尖[17]、花梗腋芽[18]、叶片[19-22]、胚[23]、花葶节间[24]、花梗节或花梗节间切段[25]和种子[26-28]等。大量的研究报道表明,不同外植体的诱导率存在差异,陈勇等[3]、杨美纯等[22]认为茎尖为外植体诱导原球茎状体发生则诱导率较高,而潘学峰等[29]、黄象男等[30]认为蝴蝶兰作为单茎性气生兰,用茎尖作为外植体有可能丧失母株,不适宜用来做诱导PLB,秦凡等[31]以茎尖、叶片为外植体进行了研究,茎尖的诱导率为70%,叶片的诱导率为37.8%。同时还发现诱导原球茎的叶片与切取的部位以及在培养基上放置的方式有关,其中,叶基部诱导率明显高于叶片中部和叶尖部位,正放在培养基上的叶片原球茎的诱导率明显高于反放和斜放在培养基上的叶片,反放和斜放在培养基上的叶片几乎不能诱导原球茎。张元国等[18]以无菌植株的茎尖、叶片、根为外植体进行研究表明,茎尖诱导率较高,只要选择好培养基且切割得当,诱导率可达100%,而叶和根诱导率太低。陈勇等[3]取无菌苗的幼叶、茎尖、根尖和花梗等为外植体,以茎尖诱导效果最佳,根尖的原球茎诱导效果最差。潘学峰等[29]认为以叶片为外植体则诱导率较低,一般不高于20%,这与秦凡等、张元国等、陈勇等报道的结果是相似的。但彭立新等[19]以花梗腋芽、花梗、幼叶片为外植体进行研究,结果表明幼叶片原球茎体诱导率最高为23%,其他2种外植体诱导率均为零。因此,培养条件、蝴蝶兰品种不同,结果也不尽相同。

蝴蝶兰PLB诱导所采用的基本培养基一般包括MS、1/2MS、VW、B5、KC、花宝及其改良型等,陈勇等[3]、姚丽娟等[21]、鲁雪华等[25]、王静等[32]研究结果均认为1/2MS适合PLB增殖,即蝴蝶兰的原球茎增殖培养以较低的无机盐浓度为好。但胡海英等[33]用MS和KC培养基,曾宋君等用G3培养基,李进进等[16]用B5培养基也有取得较好的诱导效果。因此,最适培养基的选择也不尽相同。

激素常采用6-BA,或6-BA和NAA配合使用。杨美纯等[26]、秦凡等[31]研究均表明,6-BA是决定原球茎状体发生的主要因子。秦凡等[31]在以叶片为外植体进行研究时发现,6-BA浓度为3.0mg/L时产生原球茎数目较少,但是,原球茎颗粒大,呈绿色;6-BA浓度增到15.0mg/L时产生原球茎数不断减少,且长势弱,颜色偏黄,极易玻璃化,最后褐化死亡,而2,4-D对蝴蝶兰的体细胞胚胎发生有抑制作用。黄象男等[30]利于正交试验分析结果表明,6-BA因素的极差(R)最大,培养基因素次之,NAA和AC因素最小,这和杨美纯等[22]、秦凡等[31]研究的结果是一致的。

周俊辉等[14]、王静等[32]、叶晓青等[34]、王芳等[35]均认为适宜浓度的6-BA配合低浓度的NAA更利于PLB增殖。黄象男等[30]认为6-BA浓度对原球茎的增殖速度有显著地影响,较高的细胞分裂素/生长素比值有利于增殖,而较低的细胞分裂素/生长素比值则有利于生根。但因蝴蝶兰品种及选用的外植体不同,所以最佳激素浓度也不尽相同。

蝴蝶兰的组织培养过程中易褐化[36],褐变的主要原因是材料伤口分泌出酚类化合物,在多酚氧化酶的作用下转变成醌类物质引起的[37],研究表明活性炭[30,31,35]、椰子汁[31],柠檬酸、VC[29]等物质能起到一定的缓解褐化作用。同时,pH值对褐化也有重要影响,王冬云等[38]研究表明,当培养基pH值为4.5~5.0时,培养物排出的褐变物质较多,pH值为5.4~5.5时排出的褐变物质较少。

组织培养中常用的有机添加物如椰子汁、香蕉和马铃薯等是一类含有氨基酸、矿物质、维生素、激素和酶等有机物且成分较为复杂的天然复合物[39]。多数研究证明,它们对细胞和组织的增殖和分化有明显的促进作用,许多研究人员在天然有机添加物的选择与应用方面做了大量的工作[40-42]。何松林等[39]研究发现上述有机添加物对PLB分化、幼苗等有良好的促进作用,在3种添加物中,椰子汁和马铃薯优于香蕉,而添加椰子汁的培养基对PLB分化幼苗的影响与马铃薯的差异较小,马铃薯将可能是低成本的有效添加物。研究中发现添加香蕉的培养基能显著提高幼苗的干质量,但不利试管苗叶的生长和根的分化。秦凡等[31]试验结果也表明椰子汁、马铃薯对增殖有促进作用。陈勇等[3]用椰子汁、苹果汁、马铃薯汁、香蕉汁及荸荠汁进行研究,得到了与何松林等[39]相似的结论。

除上述各因素对PLB的诱导和增殖有影响外,张元国等[18]在试验中还发现,切割或针刺对原球茎状体诱导和增殖作用效果非常好,外植体切割能明显地提高原球茎状体诱导率,增殖时切割或针刺有利于增殖而控制分化,否则原球茎很容易分化和生根。同时还发现原球茎状体增殖时有群体优势效应,刚诱导出的原球茎状体不能过早切割转移,增殖时切块应大于等于3mm,过小易褐化,导致PLB死亡。

3芽繁再生途径

无菌播种再生途径和原球茎途径具有在较短的时间内获得大量的再生植株的优点,在蝴蝶兰繁殖途径已取得较快的发展及较为广泛的应用。但无菌播种再生途径由于蝴蝶兰种子苗为杂交品系,后代变异率高,因此除了少数自花系列较稳定以外,难以形成品质均一的大规模栽培品种。PLB途径经过脱分化阶段同样也存在较高的变异率。遗传的稳定性问题一直以来都是直接影响组培苗工厂化生产的原因之一[1]。为了进一步减少变异,研究者们进行了大量的研究,王怀宇等[6]和刘荣维等[7]人提出了利用器官再生途径来实现蝴蝶兰的快速繁殖,并取了成功。该途径的优点是它是一个芽到丛芽的增殖过程,整个过程均未通过脱分化过程形成愈伤组织,保持了母株的特性,对减少品种变异是极其有利的。蝴蝶兰器官再生途径材料通常是取花梗下端的休眠芽作为外植体,通过激素、培养条件等因素的控制,诱导丛生芽,最终获得大量的再生植株[29,38,43]。其优点是不损伤母株[6,13],切取花梗后,不仅不影响母株的正常生长与花芽分化,而且还能从整体上进一步了解新品种的特征特性,特别是对新引进的新品种,可以待其开花和确定其观赏价值后再进行大量繁殖,以避免不必要的浪费。

花梗基部的休眠芽为花芽,在培养过程中可能有2种发育方向:一是形成花芽;二是形成营养芽。其不同的发育方向主要受温度和不同激素等因素的影响,如果培养的温度低(低于20℃),则容易向花芽方向分化,发育成花葶(以带腋芽的花梗节段为材料诱导花葶,可获得较多的不定芽诱导起始材料[44]);在高温条件(高于28℃)下培养易形成营养芽[29,45-47]。王冬云等[38]利用黄花蝴蝶兰的花梗腋芽为外植体,进行诱导,增殖倍数最高可达12倍,代容春等[48]以蝴蝶兰无菌幼苗(株高约1.5cm)为外植体,用MS、1/2MS、White、B5培养基进行培养,结果表明,以1/2MS促进分株最为明显。在细胞分裂素与生长素的配比中,6-BA与NAA、IBA或IAA配比均能诱导分株增殖,尤以6-BA与NAA配比分株效果为佳。对6-BA与NAA的配比进行研究发现,6-BA浓度过高、过低均不利于分株增殖;NAA 则要求较低的浓度。

潘学峰等[29]以蝴蝶兰的满天红品种为材料,取已开花的花梗,选其下端休眠芽作为外植体进行丛生芽诱导,结果表明,随着6-BA浓度的不断增加,新增的芽数也随之不断增多,增殖的倍数不断提高。但单独使用生长素不能使外植体诱导出丛生芽,只有在生长素和细胞分裂素同时存在时,才能诱导出丛生芽,其中以6-BA 12.5mg/L+NAA 0.05mg/L的处理组合效果最佳,增殖倍数可达3.00倍,所诱导出的丛生芽不仅生长健壮,而且颜色鲜嫩,有利于进一步增殖与培育壮苗。而当6-BA浓度高于15.0mg/L时,虽然诱导的丛生芽倍数不断增加,但所长出的丛生芽生长瘦弱,甚至有些还有畸形现象,不利于进一步增殖与培育壮苗。同时,在增殖阶段发现采用接双芽比接单芽的增殖效果好,发生侧芽的速度快且整齐健壮,可能是蝴蝶兰丛芽的发生也具有群体效应。

林宗铿等[47]研究表明,丛生芽的增殖率随6-BA浓度的增加而增加;同时,诱导芽的个体也随浓度的增加而变的细小。有关去茎尖对芽繁的影响试验结果表明,去掉茎尖的芽增殖率要明显的高于对照,这可能是由于去掉顶端优势,有利于诱导丛生芽。在添加附加物方面,代容春等[48]研究表明,椰子汁使增殖系数达 6.1,植株生长良好,根多,植株旺盛,而水解乳蛋白、水解酪蛋白及酵母汁均不能促进分株增殖,反而有轻微抑制的作用。

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