王娅宁　李淑娟

摘要：融合标签技术是一种基于报告基因的重组DNA技术，融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化、固定及检测更加快速、简便，并很快得到了应用。

关键词：融合标签技术；重组蛋白；应用

融合标签技术是20世纪末兴起的一种基因重组技术，其主要过程是利用重组DNA技术在靶蛋白编码基因的3'端或5'端融合某种标签的编码基因，通过适宜的宿主来表达重组蛋白质[1]，表达的重组蛋白质可以通过融合的标签与包被在固相基质上的特异配基结合而进行纯化。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。近几年，随着新的融合标签系统的开发，其功能逐渐多样化，除用于蛋白质纯化外，还用于蛋白质定位和检测等。

1 融合标签的种类

融合标签根据其分子量大小可分为两大类：大的蛋白质分子（或蛋白质结构域及其衍生物）和小的多肽片段。大的蛋白质标签有GST（谷胱甘肽巯基转移酶）、SPA（葡萄球菌蛋白A）和GFP（绿色荧光蛋白）等，它的使用会增加目标蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中，标签必须去除。小的多肽标签有6×His（六聚组氨酸）、HA（流感病毒血凝素表位）、c-myc（人c-myc蛋白表位）、FLAG（专为蛋白纯化和检测设计的八肽）等，多数情况下，由于多肽标签相对较小，对融合蛋白质结构影响小，不需要从融合蛋白质中切除，因而多肽标签较蛋白质标签更为常用。迄今为止，已有文献较为详尽地报道了各种融合标签[2]，其大小从几个氨基酸到蛋白质不等，相互作用类型包括酶与底物，细菌受体与血清蛋白，六聚组氨酸与金属离子，抗原与抗体等[3]，表1-1列出了目前报道较多的标签融合系统。

2融合标签技术的应用

2.1用于蛋白的纯化。

融合标签技术用于重组蛋白质纯化已为大量实验所证实[4]。理论上，根据亲和纯化原理可定向设计使目标蛋白质与纯化基质之间不发生任何直接相互作用的融合标签，以避免由于这种直接相互作用造成蛋白质变性。目前已有许多不同的标签可供利用。它们利用了标签与固相配体间的相互作用，从而可从复杂的提取物中对标签融合蛋白进行选择性的结合和洗脱。目前常用的蛋白纯化标签是GST，His和表位标签。

最常用的标签是多聚组氨酸，即His标签。该标签由6-10个连续组氨酸组成，置于蛋白的氨基或羧基末端。His标签与其它标签相比有很多明显优势：①对金属离子如镍、钴有高度的选择性和亲和力；②与金属离子的结合不受变性剂（尿素、胍）的影响；③温和多样的洗脱条件(100～250 mmol/L咪唑，低pH，10 mmol/L EDTA)。目前已有各种商品化介质(Ni-NTA-Agarose, Ni-IDA-Agarose)提供。另外，抗His标签的单抗或多抗也被应用于His融合蛋白的纯化。

GST标签是用来从细菌表达系统中纯化蛋白较为成功的标签之一。在该系统中，GST与被标记的蛋白进行融合，融合后的蛋白可在许多表达系统中表达。GST和谷胱甘肽紧密结合，融合蛋白可通过谷胱甘肽固相柱纯化，洗脱未结合的蛋白后，结合蛋白可用含游离的谷胱甘肽缓冲液进行洗脱。该系统中被融合的目标蛋白常可正确的折叠成为有功能的区域，故十分有用。该系统的另一个优势是可快速、温和地纯化，配体谷胱甘肽的成本较低。

表位标签（HA、c-myc和FLAG等）也已广泛用于融合蛋白的纯化研究。目前已有商品化针对表位标签的单克隆抗体。为使标签在纯化中发挥良好的作用，在纯化过程中应尽量避免使用剧烈的条件使抗体和标签之间解离，剧烈的条件可使抗原发生不可逆变性，目标蛋白的回收率低。用游离多肽竞争洗脱法洗脱结合在固相抗体上的标签融合蛋白，是优选的方法。目前，HA，微管蛋白标签[5]、KT3标签（SV40大T抗原的羧基末端）[6]和FLAG等已成功的用多肽洗脱方法进行了蛋白纯化。

2.2用于蛋白质固定和检测。

阐明蛋白质之间的相互作用，描绘出蛋白质相互作用的网络图谱是蛋白质组学研究的重要内容。用于研究蛋白质之间相互作用已有很多成熟的技术平台，如生物芯片以及基于表面等离子体共振原理的BIAcore系统。这些技术的关键步骤是将某种生物分子（蛋白质、核酸等）固定在固相基质上。利用融合标签与其配基之间的相互作用可较好地将蛋白固定在固相载体表面。融合标签通常是一些小的短肽分子或蛋白质，这些标签在目标蛋白质与固相基质之间起到了一种间隔臂(spacer arm)的作用，极大程度地减少了目标蛋白质与固相基质直接接触的机会，同时由于融合标签通常位于融合蛋白质的N端或C端，从而可使其活性中心充分展露，形成一种均质配基表面，而这种均质表面的形成对于生物芯片以及基于BIAcore系统的实验成功非常关键。不同融合标签系统的使用将为蛋白质的定向固定提供多种多样的选择。

用于蛋白检测的标签种类较多，其中荧光标签和表位标签最为常用，前者可在活细胞中进行检测，后者可用于细胞染色、免疫沉淀以及免疫印记中蛋白检测。荧光蛋白标签可对融合蛋白在活细胞中适时检测，在研究蛋白定位及其动态变化时具有特别重要的意义。最近开发出更多活性较强的标签以及发出不同颜色的各种荧光标签，极大地扩大了荧光蛋白标签的使用范围[7]。采用抗GFP抗体可将该标签用于细胞染色、免疫沉淀以及免疫印记技术中，但是，与分子质量较小的表位标签相比，分子质量较大的标签，可能更容易对目标蛋白的调节和功能产生影响。

2.3融合标签技术在其他领域的应用。

融合标签可提高重组蛋白的产量，由于外源蛋白质对于宿主菌的异质性，当外源蛋白质在宿主菌内表达时，宿主菌会调动各种机制来阻止外源蛋白质过量表达，导致的直接后果就是我们所需要的目标蛋白质表达量降低。近几年的研究发现，当外源蛋白质融合某些特定的标签后，能够有效增加重组蛋白质的产量[8]。

融合标签还可增强重组蛋白质的可溶性，外源蛋白质在宿主菌内表达时大多以包涵体形式存在[9]，致使很难获得大量有活性的天然蛋白质。为了防止包涵体形成，一般可以采用低温诱导表达蛋白质，但这种方法并非对所有蛋白质都有效。研究发现，一些高度可溶的蛋白质在与其它蛋白质融合后会促进融合蛋白质以可溶形式表达，如MBP等[10]。Invitrogen公司在2004年开发了一种新型的增强可溶性表达的多肽标签(SET-tag)，该标签是通过静电排斥来防止新生多肽相互聚集[11]。

3 展望

亲和标签在蛋白质纯化过程中有重要作用，可以帮助稳定蛋白质和提高蛋白溶解性。亲和层析得到蛋白质纯度可达90-99%。纯化系统的选择取决于蛋白质性质及下游应用。随着相关技术的发展，越来越多的融合标签系统不断被发现，极大地丰富了融合标签的功能。不同融合标签系统有其共性，同时也有各自的优势和缺点。融合标签系统的选择受到很多因素制约，如融合标签系统的纯化条件、融合蛋白质自身的性质（pI、细胞定位等）、纯化基质及缓冲液成本、融合标签的可去除性等。综合考虑融合标签的各种制约因素，尚没有一种标签可以满足所有应用的需要。因而，两种甚至多种不同融合标签的组合使用将成为未来融合标签技术的发展趋势。

参考文献:

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