张　凤

【摘要】本文对两种生化指纹图谱技术在作物品种鉴定中的应用及研究作了综述，并对他们的优缺点和前景作了探讨。

【关键词】生化指纹图谱；品种鉴定；种子纯度

指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的电泳图谱，此电泳图谱多态性丰富，具有高度的个体特异性和环境稳定性，像人的指纹一样，因而被称为“指纹图谱”。它是鉴别品种、品系的有力工具，指纹图谱技术具有可靠方便、准确快速、不受环境影响等特点，反映了个体间的内在差异，因而极其适合于品种的鉴定工作。

目前在品种鉴定中应用较多的指纹图谱主要有两种：一类是较早开始研究的生化指纹图谱，包括同工酶电泳指纹图谱和蛋白电泳指纹图谱。另一类是九十年代之后发展起来的DNA指纹图谱，目前用于作物品种鉴定的主要有四种：RFLP、RAPD、SSR、AFLP。本文就两种生化指纹图谱技术的研究和应用进行综述，以期为农业生产服务。

1.同工酶电泳指纹图谱

同工酶差异主要是由决定酶蛋白本身的等位基因和非等位基因的差异造成，同工酶谱是基因表达后分子水平的表型，通过其谱带的分析能快速简便的识别出编码这些谱带的基因位点和等位基因。由于几乎25％的基因位点具有多态性,一般不同同工酶酶谱的差异表现为同一基因位点上的等位基因的差异，在分离群体中能区分所有可能的基因型，因而可用作指纹图谱。

从1959年Market和Moller首次提出同工酶的概念以来，同工酶研究得到了迅猛发展。70年代初期，同工酶电泳技术就应用于种子纯度鉴定。1973年，Singh利用酯酶同工酶、亮氨酸氨肽酶及磷酸酶同工酶的淀粉凝胶电泳，对10个燕麦品种进行鉴定，结果表明，每个品种都具有其特有的酶带，证明了利用同工酶电泳鉴定种子纯度的可靠性。1976年，Woods对抱球甘蓝进行了同工酶的淀粉凝胶电泳鉴定。

80年代以后，电泳方法不断改进，分析技术越来越精确，逐渐采用聚丙烯酰胺凝胶电泳。Nielsen（1986）综合分析了1979-1986年间不同同工酶和不同电泳方法在大麦品种纯度上的鉴定后，认为聚丙烯酰胺凝胶电泳法是最具有潜力的品种纯度鉴定方法。利用这一技术，Freeman（1991）对早熟禾种子纯度进行了鉴定，并制作了一系列早熟禾品种的酯酶同工酶酶谱，以便于对照比较。国内，最早将这项技术应用于种子纯度鉴定的陆士伟[1]利用酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳测定了杂交水稻种子的纯度。颜启传[2]利用这一技术检测了杂交水稻及其三系种子的真实性和品种纯度，研究证明此方法具有灵敏度高、准确、经济、易于操作等优点。张春庆[3]利用过氧化物同工酶电泳鉴定了玉米自交系及其杂交种的纯度，取得较好的效果。

90年代以后，同工酶电泳技术广泛应用于作物品种纯度鉴定上，许多工作者在水稻、玉米、大白菜等作物品种纯度鉴定方面做了大量的工作，取得了良好的经济效益。

同工酶电泳酶带的显现灵敏，较易获得成功，一次可进行多种酶的分析，从而大大提高了种子纯度检测的功效，具有速度快、费用低、准确度高等优点[4]，因此一度应用于作物纯度检测。然而，同工酶的表达在时间和空间上的特异性又影响着同工酶在不同组织或器官中的分布与活性。酶的提取和电泳技术的实验条件要求严格，可利用的同工酶非常有限,并有酶谱不纯的现象，因而在生产实践中未得到推广应用。

2.蛋白电泳指纹图谱

蛋白质作为基因的直接稳定产物，能反映生物DNA组成上的差异，但适合鉴定品种的基因产物必须在品种间存在较高的多态性，且易于检测出来。植物胚乳（种子）贮藏蛋白就是符合要求的一类基因产物，这些蛋白的组成由遗传决定，不受环境影响，其组分上的差异可反映出基因型的不同，因而可作为品种的“生化指纹”。

自70年代以来，蛋白质电泳作为鉴定品种的一种方法引起了人们的极大兴趣。Ellis（1977）利用淀粉凝胶电泳分析了29个英国小麦品种的醇溶蛋白，除极个别外，这些品种都能被区分开。他们认为，每品种分析50粒种子，既不需花费很多时间，又能保证结果统计的准确性。Shewry（1978）利用SDS-PAGE技术对大麦种子醇溶蛋白进行了分析，成功地将88个大麦品种分为29个种类，显示了醇溶蛋白电泳技术在品种鉴定上的巨大价值。Lookhart（1982）建立了一种标准化的麦醇溶蛋白鉴定技术。1986年，国际种子检验协会将大麦、小麦品种醇溶蛋白电泳鉴定技术列入国际种子检验规程。Cross对玉米的胚蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，成功区分了自交系和杂交种。Anisimova（1989）对53个向日葵品种的球蛋白电泳图谱进行比较，表明球蛋白多态性丰富，可用于品种、自交系同质性和遗传纯度的鉴定。Varier（1992）利用球蛋白的SDS-PAGE技术对向日葵的4个杂交种及其亲本自交系进行了研究，总共检测到了27条带，除3条共有带外，其他带的有无可以决定品种间基因型的不同。

此后，蛋白质电泳鉴定种子纯度技术迅速发展起来，广泛应用于小麦、玉米、番茄等作物。同时电泳技术也日臻完善，在品种鉴定和纯度分析中主要有以下两种方法，即根据蛋白质等电点不同来分离的等电聚焦电泳法（IEF）和根据蛋白质分子量不同来分离的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。此外，毛细管电泳技术（CE）、超薄等电聚焦电泳技术（UTLIEF）、酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（Acid-PAGE）、双向电泳技术（2-D）、高效液相色谱技术在蛋白质分离方面也有很多应用，并显示了强大的优势。

蛋白质电泳技术是目前种子纯度检验中广泛适用的方法。蛋白质提取容易，无需低温，需时较短，成分数量稳定，具有较高的准确性和广泛的适应性[5]。但值得注意的是，由于基因表达有时会受到器官、发育阶段甚至环境条件的影响，故进行电泳鉴定时，除了电泳条件的适当选择外，试验材料的采集也直接影响了鉴定的准确性。另外对于某些遗传组成非常接近的品种，如保持系和不育系，不易找到特异蛋白，采用蛋白质电泳难以发现特征带。此外，蛋白质电泳图谱易受种子发育阶段及表达器官的影响，有时不够稳定，影响了电泳图谱的分析，从而影响了鉴定结果的准确性[6]。并且，随着近几年杂交组合的不断推陈出新，品种之间的差异甚微，亲缘关系较近，鉴定更加困难。

3.结语

纯度是种子重要的质量指标，也是种子分级的主要依据。低纯度、真实性差的种子给农业生产带来极大的损失。再者，在短期经济利益的驱动下，一些不法分子常以牺牲种子纯度为代价来获取高额利润，损害消费者的利益，严重影响了正常的农业生产，成为全国良种推广、总产提高的一大潜在障碍。指纹图谱标记是近年来发展快、应用面广、准确性较高的种子纯度鉴定方法，它在分子水平上对不同遗传特性的种子给予辨别，有准确、可靠、快速和不受外界环境条件影响的特点。采用指纹图谱技术建立一套主要作物的标准指纹图谱，对防止伪劣种子流入市场，提高种子市场规范化具有重要意义。

参考文献

[1]陆士伟,黄炳权,邝章标等.应用酯酶同工酶测定杂交水稻杂种纯度的研究.中国农业科学,1982,(15):10

[2]颜启传.杂交水稻三系及其杂交种种子真实性鉴定和纯度检验.种子,1984,(3):15-18

[3]张春庆等.NAV-PAGE技术与玉米种子纯度测定.中国农业科学,1995,（6）：20-24

[4.]文方德,李卓杰，傅家瑞.种子纯度鉴定技术进展及其评论.种子,1995,(5):36-38

[5]严莉等.现代生物技术在作物品种纯度鉴定上的研究进展.种子,2002,(6):45-46

[6] 管晓春,刘康.浅谈种子纯度及真实性室内鉴定.种子,1998,(3):74-76

作者简介：张凤（1979—），女，研究生，讲师，研究方向：植物分子发育生物学。