王芸 刘玉平 刘义满 柯卫东

（武汉市蔬菜科学研究所，湖北武汉，430065）

分子标记技术在莲遗传多样性分析中的应用

王芸 刘玉平 刘义满 柯卫东

（武汉市蔬菜科学研究所，湖北武汉，430065）

分子标记是继形态标记、细胞标记、生化标记之后出现的一种全新的遗传标记方法，已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域。主要介绍了现阶段常用的几种分子标记技术，以及这些标记技术在莲遗传多样性分析中的应用，并对其应用前景进行了展望。

分子标记 莲 遗传多样性

分子标记是继形态标记、细胞标记、生化标记之后出现的一种全新的遗传标记方法，是DNA分子水平上遗传多态性的直接反映。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，哪怕是单个核苷酸的变异。因此，DNA标记在数量上几乎是无限的。相比以往的遗传标记，分子标记技术具有很多特殊的优点，例如无表型效应、不受环境限制与影响等等。由于分子标记直接利用DNA分子中可读的核苷酸序列变异信息，为遗传育种提供了大量的基因组信息，所以现阶段分子标记技术已广泛地应用于种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和克隆以及分子标记辅助选择育种等各个方面。

近年来，在国内，有用RAPD，AFLP，ISSR等分子标记对中国莲藕的研究报道[1～3]。

1 分子标记在莲遗传多样性分析中的应用

1.1 亲缘关系分析

目前，有研究表明分子标记技术更能直接从分子水平上揭示莲藕不同品种之间的差异和相关性。彭欲率等[4]利用AFLP对12个莲藕品种进行了多态性分析，并用UPMGA方法进行聚类分析从而显示这12个莲藕品种之间的亲缘关系，聚类分析的结果与品种的谱系关系是相当吻合的。韩延闯等[5]采用RAPD技术对14个莲藕品种进行遗传多态性分析，用5个Operon引物和80个SBS的RAPD引物进行筛选，从中选出来自SBS的RAPD-C13和RAPD-D15扩增出的8条多态性条带，绘制了14个品种的DNA指纹图谱，在该图谱中每个品种均有各自特异的DNA指纹。郭宏波等[6]利用17个随机引物对32份莲属（Nelumbo）品种资源进行RAPD分析。扩增形成207条谱带，其中多态性条带193条，占93.23%，显示该属植物在我国具有丰富的遗传多样性。分析结果还表明莲属种质资源可分为3个品种群：花莲、籽莲和藕莲，这与传统的园艺学分类相一致；美洲黄莲与中国莲的花莲之间在DNA水平上差异不大，遗传背景与花莲更相似；藕莲、籽莲和花莲可能由不同遗传背景的野莲演化而来。薛建华等[7]对黑龙江流域、松花江流域和乌苏里江流域采集的49份野生莲和全国各地的27份栽培莲进行ISSR和RAPD分析发现，野生莲的遗传多样性低于栽培莲。潘磊等[8]采用FIASCO（Fast Isolation by AFLP of Sequence Containing Repeats）微卫星分子标记，利用磁珠表面的链亲和素与生物素标记的SSR探针之间的结合，从而达到富集SSR的目的。该研究采用磁珠富集法分离筛选莲藕的微卫星分子标记，同时，筛选获得的SSR分子标记可以为莲藕种质资源亲缘关系的鉴定、遗传多样性的检测和遗传图谱的构建等打下基础。

总之，分子标记技术的利用，使从DNA分子水平上研究莲遗传多样性成为可能，分子标记在分析莲不同品种的系谱关系、亲缘品种群间的系统发生关系及分类地位等方面都起着重要的作用[9]。

1.2 品种鉴定

莲藕是通过无性繁殖繁衍后代的水生蔬菜，其个体差异并不是那么明显，人们仅仅依靠传统的形态特征观察难以识别，而通过分子标记手段来鉴定则更加准确。孔德政等[10]利用RAPD标记技术，对8个碗莲品种进行了遗传多态性分析，从70个10碱基随机引物中，筛选出多态性频率较高的引物4个，扩增后共得到14条多态性条带，平均多态性为70%。选择6条清晰度高的多态性条带绘制8个碗莲品种的指纹图谱，在该图谱中每个品种均有各自特异的DNA指纹。该项研究结果为碗莲品种的鉴定和保护提供了一种有效的方法。全志武等[11]在开发出莲基因组SSR引物对的基础上，采用SSR分子标记技术尝试鉴别10个藕莲推广品种。筛选出16对SSR有效引物进行PCR扩增，其中6对引物CL1，CL2，CL4，CL9，CL14，CL16共扩增出15条多态性条带，对所得到的10个藕莲品种的SSR指纹图谱进行组合和综合分析，可以将供试的10个品种区分开来，该项研究表明利用SSR技术进行藕莲品种鉴定是可行而有效的。

1.3 莲遗传育种研究

现阶段杂交育种仍是莲遗传育种的主要技术之一，而杂交亲本的选配是杂交育种的关键步骤。亲本的选配必须考虑的一个重要因素是测定亲本的遗传距离，确定其亲缘关系。传统育种方法主要是利用表型特性来确定其亲缘关系，由于莲藕的一些重要农艺性状遗传能力往往较弱，或者极易受到坏境等因素的影响，这种方法难免效率偏低。分子标记由于受环境因素影响小，且数量多，因而可以快速鉴别亲本之间的亲缘关系，从而使人们在育种筛选过程中节省大量的人力物力和时间。

瞿桢等[12]利用分子标记SRAP（相关系列扩增多态性，sequence-related amplified polymorphism）技术对国内广泛栽培以及新近育成的39个莲品种进行了DNA多态性分析。选取5对引物扩增基因组DNA，共获得101条条带，其中88条为多态性条带，每对引物平均提供20个标记信息。由UPMGA方法得到的聚类分析结果表明了39个品种间的遗传关系，结果表明，花莲、籽莲和藕莲三大类群有明显的界限，花莲和籽莲的遗传距离较近，藕莲与它们的遗传距离较远。分子方差分析结果表明，莲品种间和品种内均存在遗传变异，藕莲品种内的遗传变异略低于品种间的遗传变异，而诱变籽莲、诱变花莲和常规籽莲品种内遗传变异均大于品种间的遗传变异，尤其是诱变籽莲、诱变花莲品种内遗传变异占总变异的分量分别超过了70%和60%，这种品种内的遗传变异，一方面对于莲的高产稳产具有重要的意义，另一方面也说明了从这些国内广泛栽培的品种以及新近育成的莲品种中可以直接进一步选育出更优良的新品种。

2 展望

分子标记技术作为常规育种有力的辅助工具，已经受到国内外作物育种界的普遍重视。分子标记为莲遗传多样性研究开辟了新的途径。它在基因组图谱构建、基因定位、品种鉴定、种质资源评价及杂交育种等方面已显示出非常诱人的前景。但要将分子标记广泛而深入地应用到遗传育种的各个领域，还应注意以下几个方面：第一，寻找新型的分子标记方法；第二，简化分子标记技术，降低实验成本，实现检测过程的自动化；第三，改进分析基因组的方法和技术。另外，由于标记鉴定与辅助育种还有很大的脱节，因此还需要进一步的完善。我们相信随着分子标记技术的日臻完善，它必将在植物育种中发挥越来越重要的作用。

[1]汪岚，韩延闯，彭欲率，等.ISSR标记技术在莲藕遗传研究中的运用[J].氨基酸和生物资源，2004，26（3）：20-22.

[2]Xue J H,Zhuo L H,Zhou S L.Genetic diversity and geographic pattern of wild lotus (Nelumbo nucifera)in Heilongjiang Province[J].Chinese Science Bulletin，2006，51 (4)：421-432.

[3]Han Y C,Teng C Z,Zhong S,et al.Genetic variation and clonal diversity in populations of Nelumbo nucifera(Nelumbonaceae)in central China detected by ISSR markers[J]. Aquatic Botany，2007，86：69-75.

[4]彭欲率，韩延闯，汪岚，等.应用AFLP技术检测莲藕遗传多样性的初步研究[J].分子植物育种，2004，2（6）：823-827.

[5]韩延闯，刁英，周立，等.莲藕品种DNA指纹图谱的绘制[J].武汉植物学研究，2004，22（3）：193-196.

[6]郭宏波，柯卫东，李双梅，等.不同类型莲资源的RAPD聚类分析[J].植物遗传资源学报，2004，5（4）：328-332.

[7]薛建华，卓丽环，周世良.黑龙江省野生莲的遗传多样性及其地理式样[J].科学通报，2005，51（3）：61-70.

[8]潘磊，郑鹏，徐杰，等.磁珠富集法制备莲藕基因组的微卫星分子标记[J].中国蔬菜，2007（增刊）：7-13.

[9]周奕华，陈正华.分子标记在植物学中的应用及前景[J].武汉市植物学研究，1999，17（1）：75-86.

[10]孔德政，刘艺平，杨秋生.8个碗莲品种的DNA指纹鉴定[J].南京农业大学学报，2009，32（2）：147-150.

[11]全志武，汪静，潘磊，等.10个莲藕品种SSR指纹图谱的构建与品种鉴定[J].中国蔬菜，2008（3）：15-17.

[12]瞿桢，魏英辉，李大威，等.莲品种资源的SRAP遗传多样性分析[J].氨基酸和生物资源，2008，30（3）：21-25.

Application of Molecular Markers in Genetic Diversity of Lotus(Nelumbo)

WANG Yun,LIU Yuping,LIU Yiman,KE Weidong

Molecular markers are one kind of new genetic markers following the morphological markers,cytological markers and biochemical markers.Therefore they have been extensively applied in each areas of life science.Some commonly used methods of molecular markers and their application in genetic diversity of lotus was introduced.And the prospect of their application was also discussed.

Molecular markers;Lotus;Genetic diversity.

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.16.003 Gaertn.）

王芸，女，博士，主要从事水生蔬菜遗传多样性研究，电话：027-88116313。E-mail:wdland1981@163.com

2009-07-22