范 寰 梁军峰 赵 润 张金凤 张洪生

摘要:对木质素降解的研究进展、白腐真菌对木质素降解的机理以及白腐真菌在饲料资源开发中的应用进行了综述,并对白腐真菌在木质素降解中的发展方向做了展望。

关键词:白腐真菌;木质素;降解;木质素降解酶

中图分类号:S816.3文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.007

Role of White Rot Fungi in Microbial Degradation of Lignin

FAN Huan1,2,LIANG Jun-feng3,ZHAO Run3,ZHANG Jin-feng3,ZHANG Hong-sheng3

(1.Tianjin Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Tianjin 300112,China;2.Tianjin Research Center of Agricultural Biotechnology,Tianjin 300192,China;3.Agro-environmental Protection Institute,Ministry of Agriculture of China,Tianjin 300191,China)

Abstract:In this article, the development in lignin degradation and the degradation mechanism by white rot fungi and the application of white-rot fungus in animal feeds production were reviewed. And an exploration of future technical and strategic improvements in lignin biodegradation by white rot fungi was respected.

Key words:white rot fungi;lignin;degradation;ligninolytic enzymes

白腐真菌(white rot fungi)是指着生在木材上,菌丝穿入木质,侵入木质细胞腔内,能释放降解木质素和其他木质组分的酶,以降解木材中的木质素、纤维素、半纤维素,引起木质白色腐烂的丝状真菌的集合。白腐真菌的种类很多,绝大多数为担子菌,少数为子囊菌。主要分布在革盖菌属(Coriolus)、卧孔菌属(Poria)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、侧耳属(Pleurotus)及烟管菌属(Sjekandera)等[1]。白腐真菌中研究历史最久、关注最多、研究最透的是黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium Burdsal)[2]。白腐真菌是已知的唯一能在纯系培养中有效地将木质素降解为CO2和H2O的一类微生物。近半个世纪,白腐真菌所具有的独特的生理生化机制和强大的降解代谢能力,使其受到许多研究者的高度关注。

1木质素降解的研究

木质素是自然界中除了纤维素外的第二大聚合物,它不仅对农业、工业、环境有着重要的影响,也与人们的生活息息相关,是一种有价值的潜在能源。饲料中的粗纤维主要包括纤维素、半纤维素和木质素,很难被动物消化道产生的酶所消化吸收。其中反刍动物瘤胃微生物可以部分降解纤维素、半纤维素,对于木质素很难降解;而单胃动物对于粗纤维各种成分的消化利用更为有限。研究表明,木质素可以通过各种化学键与纤维素、半纤维素相连,形成更加复杂的物质——木质纤维素,因为木质素的存在,导致粗纤维系统中纤维素、半纤维素的降解率降低,因此木质素是影响饲料粗纤维消化率的限制因子。由于木质素与半纤维素、纤维素之间相互混杂和交联,使得原可以被瘤胃微生物降解的纤维素及其它可消化营养成分也难以被降解,因此降低木质素含量、破坏其结构单元之间连接的各种共价键,对于提高农作物秸秆的营养价值具有重要意义。有试验证明,由于粗纤维对猪消化道消化液的稀释作用,消化酶对底物的作用受到限制,从而降低了淀粉消化率。廖玉英[3]等研究发现,随着鹅日粮中粗纤维水平的增加,饲料转化率和日增重显著下降。

木质素由3种以苯丙烷为主体的木质素单体组成,包括愈创木基结构、紫丁香基结构和对羟苯基结构,也有认为木质素是由四种醇单体(对香豆醇、松柏醇、5-羟基松柏醇、芥子醇)形成的一种复杂酚类聚合物。木质素单体通过醚键等化学键相连,形成具有三维网状结构的大分子芳香族化合物。在植物细胞形成过程中,木质素和纤维素、半纤维素等交联沉积在细胞的初生壁和次生壁中,木质素还可与多糖通过阿魏糖桥交联从而影响了纤维多糖的微生物降解,木聚糖彼此交联及与木质素的交联使细胞壁不易降解,只有低于50%的纤维部分可被动物消化吸收。木质素作为一种物理屏障降低了饲料的营养价值。因此,降低饲料细胞壁中木质素含量,使木质化细胞易被消化,则能显著提高饲料的可消化性和利用率。

目前,木质纤维素的处理方法大致可分为物理法、化学法、物理化学法以及生物法[4]。物理处理技术主要有:机械粉碎、微波、超声波、高能电子辐射、热解等。物理方法处理时间短,操作简单,但设备投资费用高。化学处理方法主要是:酸处理、碱处理、氧化处理、氨水浸泡处理、氨回收浸没(ARP)处理、石灰处理等,但存在腐蚀和毒性等缺点,易造成环境污染,需回收。生物法主要研究的有真菌(白腐菌、褐腐菌、软腐菌)、基因工程菌、酶类(多酚氧化酶、漆酶、过氧化氢生成酶、苯醌还原酶)等。生物法具有能耗低、无污染、条件温和等优点,但周期长[5]。

2白腐真菌对木质素降解机理的研究

2.1木质素降解酶系的组成

白腐真菌所具有的降解木质素的能力源于白腐真菌所产生的酶系统,分解木质素需要依靠一个复杂的胞外过氧化物酶系统,这一系统主要由3种酶构成:木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(MnP)、漆酶(Lac),另外还有其它几种酶的综合作用[6]。与降解有关的酶只有当某些主要营养物(如氮、碳、硫)限制时才形成。由于营养限制使真菌应答产生了对底物的降解系统[7]。

2.2白腐真菌木质素降解酶系的降解机理[8]

降解是以自由基为基础的链反应过程。在有氧条件下,H2O2激活过氧化物酶,过氧化物酶触发启动高度活性的自由中间体形成,继而以链反应过程产生许多不同自由基,促使底物氧化。这种自由基反应是高度非特异性和无立体选择性的,即白腐真菌与被降解底物并非酶与底物的一一对应关系,而是与一类乃至多类底物的关系[9]。

LiP和MnP均为血红素蛋白,催化过程中依赖H2O2。一般认为,LiP首先从木质素或木质素模型化合物中产生一个电子,形成阳离子基团,进而导致裂解反应,引起丙基侧链Cα—Cβ链断裂,后者再经历一系列非酶反应产生各种终产物。

MnP既可氧化酚型结构也可氧化非酚型结构,其能将Mn(II)氧化成Mn(III),而Mn(III)是氧化剂,可在离MnP活性位点一段距离的地方起作用,但不能氧化非苯酚结构,只能通过Cα芳基开裂和其他降解反应氧化木质素中约占10%的抗性更强的酚结构。

Laccase是一种含铜多酚氧化酶,主要攻击木质素中的苯酚结构单元,在反应中,苯酚的核失去一个电子而被氧化,产生含苯氧基的自由活性基团,可导致Cα氧化、Cα—Cβ裂解和烷基芳香基裂解。由于Laccase同时具有催化解聚和聚合木质素的作用,因此单独存在时不能降解木质素,只有同时存在MnP等其他酶,避免反应产物重新聚合时,才有较高的木质素降解效率。漆酶可在仅有碳源存在的条件下由菌体分泌,并且具有780 mV氧化还原电位,在没有H2O2和其他次级代谢产物的存在下可催化有机污染物的氧化[10]。

3白腐真菌在饲料资源开发中的应用

3.1白腐真菌提高秸秆饲料的品质及利用率

农作物秸秆营养成分的特点是蛋白质、可溶性碳水化合物、矿物质的含量低,而粗纤维含量高达35%～40%,还含有6%～12%的木质素,无氮浸出物达40%～50%。秸秆的营养价值主要取决于秸秆有机物的消化利用程度。在秸秆有机物中,纤维素、半纤维素和木质素是微生物重要的分解对象,而木质素由化学特性十分稳定的化合物形式构成,极难被一般微生物分解,动物无法吸收利用。纤维素和半纤维素易被微生物或酶分解,但木质素是纤维素的外围基质,将纤维素紧紧包裹在其中,并且家畜瘤胃微生物缺乏降解木质素的酶,从而阻碍了家畜对纤维素和半纤维素的有效利用,导致秸秆的消化率降低。因此,提高农作物秸秆利用率的关键就是降解木质素[11]。

白腐真菌可使秸秆中木质素降解率达到20%~60%,纤维素和半纤维素降解率达到20%~40%,干物质损失10%~40%。用白腐真菌发酵切碎的麦秸,1个月后不仅粗蛋白质含量有所提高,且秸秆的消化率可提高2~3倍。用白腐真菌发酵稻草时,发酵后其木质素含量降低13.7%~29.9%。蛋白质含量增加24.6%~72.4%。由于大部分木质素被降解或破坏,秸秆质地变柔软,适口性改善,明显提高了秸秆的体外干物质消化率(IVDMD)。

用20多种白腐真菌处理秸秆的研究表明:白腐真菌表现出较强的种间变异,同时培养发酵的条件不同,处理秸秆的效果也不同。但是经筛选和选育的优良菌种,在适当环境条件下,固体发酵能显著地改善秸秆的营养价值。检测表明,最佳的白腐真菌能使秸秆体外降解率从40%提高到59%。白腐真菌处理的秸秆不仅营养成分有极大提高,而且其酸度由未处理前的pH值 5.17降至4.10左右,呈水果香味,同时由于大部分木质素被降解或破坏,秸秆质地柔软适性明显改善[12]。

3.2混菌发酵生产蛋白质饲料

应用白腐真菌处理秸秆,可以提高秸秆的利用率,但是一些降解产物仍得不到充分的利用。为此,科研人员利用白腐真菌降解秸秆木质素的能力和其它微生物发酵生产蛋白质饲料或单细胞蛋白(SCP)的能力,进行混菌发酵。陈庆森等[13]以玉米秸秆为原料,利用多菌种混合发酵,经测定发酵液中玉米秸秆的纤维素利用率达70%,粗蛋白质得率在23%以上,大大提高了玉米秸秆的营养价值。齐刚[14]以酒糟和稻草为基质进行混菌发酵,分别比较了白腐菌单菌发酵、酵母菌单菌发酵和二者混菌发酵对蛋白提高的影响。实验表明,混菌发酵对蛋白提高的贡献最大。通过比较酵母菌不同接种时间,发现白腐菌培养20 d后接人酵母可使蛋白含量达到6.45%。

4白腐真菌降解木质素的局限性和发展方向

白腐真菌以其独特的生理生化机制和强大的降解代谢能力而成为木质素降解研究的模式菌株。白腐真菌虽然是降解木质素最有效的微生物,但由于其培养时受许多外部条件的影响,因此,目前大多数的研究还仅限于实验室的发酵处理。而且在自然状态下,白腐真菌的定植缓慢,很难形成优势种群,这是该菌用于木质素降解并进入产业化的最大障碍。目前,生物降解多采用混合发酵,但由于菌种的不同来源和相容性的差异,各个菌株之间营养条件和生长条件有所不同,使混合发酵降解率也受到限制,至今不能达到高降解的目的[15]。因此,筛选出高效低能耗的木质素分解菌种以及能在饲料上迅速生长,且与杂菌在生长竞争中处于生物量的绝对优势的优良菌种,并采用分子生物学方法构建具有木质素降解基因和纤维素酶基因的工程菌[16,17],是未来的发展方向。随着白腐真菌基础研究和应用研究的进展,其在畜牧业中将得到更广泛的应用,将为我国饲料资源的开发利用提供更广阔的空间。

参考文献:

[1] 许云贺,张莉力,王凤娥,等.白腐真菌研究进展[J].畜牧兽医科技信息,2007(12):11-12.

[2] Singh D,Chen S L. The white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium: Conditions for the production of lignin-degrading enzymes[J]. Applied Microbiology Biotechnology,2008,81(3):399-417.

[3] 廖玉英,杨家晃,韦凤英,等. 日粮粗纤维水平对广西合浦鹅生长性能的影响[J].广西畜牧兽医,2004,20(6):243-245.

[4] 杨长军,汪勤,张光岳. 木质纤维素原料预处理技术研究进展[J]. 酿酒科技,2008(3):85-89.

[5] 张辉,戴传超,朱奇,等.生物降解木质素研究新进展[J].安徽农业科学,2006,34(9):1780-1784.

[6] 刘玲,叶博,刘长江. 白腐真菌及其木质素酶的研究进展[J].饲料工业,2006,27(8):25-28.

[7] Zmitrovich I V,Psurtsevan V,Belova N V. Evolutionary and taxonomical aspects of search and study of lignin-degrading fungi active producers of oxidative enzymes[J]. Mikologiyai Fitopatologiya,2007,41(1):57-58.

[8] 张辉.木质素降解酶系研究新进展[J].天津农业科学,2006,12(3):8-12.

[9] Higuchi T. Microbial degradation of lignin: Role of lignin peroxidase, manganese peroxidase, and laccase[J]. Proc Jpn Acad B,2004,80(5):204-214.

[10] 梁帅,周德明,冯友仁. 白腐真菌漆酶的研究进展及应用前景[J].安徽农业科学,2008,36(4):1317-1319.

[11] 胡建宏,丁海荣,王立强. 利用白腐真菌开发农作物秸秆饲料的研究[J].饲料工业,2005,26(11):57-59.

[12] 王洪春,王凤娥.白腐真菌研究与秸秆利用[J].江西饲料,

2008(1):29-30,39.

[13] 陈庆森,刘剑红,潘建阳,等. 利用多菌种共发酵技术转化玉米秸秆的研究[J].食品与发酵工业,2002,25(5):1-6.

[14] 齐刚.白腐菌降解秸秆木素及饲料化研究[D].天津:天津科技大学,2004:44.

[15] Chi Y J,Hatakka A,Maijala P . Can co-culturing of two white-rot fungi increase lignin degradation and the production of lignin-degrading enzymes[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2007,59(1):32-39.

[16] 喻云梅,刘赟,翁恩琪,等.白腐真菌木质素降解酶的产生及其调控机制研究进展[J].安全与环境学报,2005,5(2):82-86.

[17] 董亮,谢冰,黄民生,等. 白腐真菌酶学与分子生物学研究进展[J].环境科学与技术,2005,28(5):102-104.