邢瀚文 季 静 王 罡 杜长城 杨少辉 宋英今

摘要:对近年来月季和玫瑰遗传转化体系的建立和遗传转化研究进展进行了简要综述,为它们建立高效遗传转化体系奠定了理论基础。

关键词:月季;玫瑰;植株再生;遗传转化

中图分类号:S685.12文献标识码:ADOI编码:10.3969/j.issn.1006-6500.2009.05.004

Advances in Genetic Transformation Systems of Roses

XING Han-wen1,JI Jing1,WANG Gang1,DU Chang-cheng2,YANG Shao-hui1,SONG Ying-jin1

(1.College of Agriculture and Bioengineering,Tianjin University,Tianjin 300072,China;2.Tianjin Forestry Bureau,Tianjin 300061,China)

Abstract:System establishment and researches of genetic transformation of rose in recent years were reviewed in this article, in order to lay a theoretical foundation for the establishment of efficient genetic transformation system of rose.

Key words:Chinese rose;plant regeneration;genetic transformation

月季( Rosa hybrida L.) 和玫瑰(Rosa rugosa)都是蔷薇科蔷薇属植物,是世界上最重要的观赏植物之一,世界四大切花之一,也是各类高级食品、化妆品的重要香料原料,因而具有极高的商业价值。目前,月季和玫瑰育种是花卉育种较活跃的领域,主要集中在对花色、花形、开花习性、鲜切花寿命、株型、抗病性等的改良上[1]。但是传统的育种方法存在着诸如:为多年生灌木,育种所需时间较长;基因资源有限,染色体数目及倍性差异使远缘杂交难以成功;生长一致性、开花同时性等多基因控制性状难以改良等问题。

20世纪90年代发展起来的以组织培养为基础的转基因技术为月季和玫瑰育种提供了一条新途径。这种方法不但使品种在外源基因所控制的性状上发生改变,其性状保持相对稳定,还可利用来自其他生物类型的基因,创造更优良的品种[2]。笔者着重介绍了月季遗传转化体系的建立及遗传转化方面的研究进展,为进行月季基因工程改良,培育月季优秀新品种提供借鉴。同时,玫瑰与月季在遗传转化方面非常相似,在此不再赘述。

1月季遗传转化体系的建立

月季遗传转化体系的建立是转基因技术的重要前提条件,转基因成功与否在很大程度上依赖于再生体系是否高效。植株再生可通过器官发生途径和体细胞胚发生途径实现,依据是否经过愈伤组织阶段进一步分为直接再生和间接再生两种[2]。目前可以通过直接再生、间接再生、体细胞胚再生等方法建立月季遗传转化体系[3]。

1.1直接再生

Lloyd等[4]在仅含有BA和NAA的培养基上直接从桃子(R. persica×R. xanthina)的叶和根,金英子(R.1aevigata)和光叶蔷薇(R.wichuraiana)的叶上诱导出不定芽,但未报道诱导率。Dubois和de Vries等[5]报道在1/2MS + TDZ 6.8 μmol/L + NAA 0.27 μmol/L的培养基上,可从叶片直接再生不定芽,切花月季品种不同,分化情况不同。这是目前所报道再生率最高,需时最短的再生方法。最大发生率是在叶片基部和叶鞘基部,加入AgNO3可以缩短不定芽发生时间,提高不定芽再生频率。再生率越高的品种,再生所需时间越短,不定芽生长越快,且再生芽数也越多,并且田间苗较组培苗的效果好。

1.2间接再生

芽体再生主要以根、节间、叶片、叶柄等为外植体,但对这方面的研究报道并不多。诱导愈伤的基本培养基为MS、SH、N6等,激素有BA、GA、2,4-D、NAA、KT等。诱导芽体的基本培养基有MS、1/2MS、改良MS培养基等,激素有BA、NAA等。诱导不定芽再生率通常不高,并且非常受基因型的限制,具有器官发生能力的愈伤组织也无法继代增殖,因此,此再生途径的应用有一定的局限性。

1.3体细胞胚再生

多以叶片、节间、雄蕊花丝、根和合子胚等为外植体。品种不同,外植体不同,对愈伤组织的诱导、体细胞胚的发生以及再生植株的形成有重要影响。品种,即基因型是最重要的影响因素,一些月季品种在目前的研究中没有获得再生。Noriega和Sondahl指出体细胞胚再生过程中重要的一步是从初级体细胞胚上诱导和保持脆性胚性愈伤组织,低水平的NAA/ZT(玉米素)有利于诱导,而高水平的NAA/ZT有利于保持。

影响体细胞胚再生的培养条件有温度、光照等。体细胞胚发育前期适当的低温培养(4～8 ℃)有利于体细胞胚的萌发,同时还需要生长素和细胞分裂素。Dohm等[6]报道体胚的萌发是零星发生的,Kim等[7]报道的体胚萌发率为11%。为提高萌发效率采取的措施主要是强光照、低温和ABA处理。Yokoya等[8]采用ABA和低温联合处理,并使用麦芽糖代替蔗糖,通过胚的萌发和不定芽的再生,使25%的体细胞胚成苗。

2月季的遗传转化研究

目前,月季转化系统大多采用胚性愈伤组织或体细胞胚进行转化,但其再生系统还不够完善,主要表现为再生率不高,且明显受基因型限制。因此,月季转基因的报道还很有限。

郑玉梅等目前用于月季转化的报告基因有新霉素磷酸转移酶(nptⅡ)基因、β-葡萄糖酸苷酶(GUS)基因、荧光酶素(LUC)基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因。通过利用报告基因可以进行转基因植株的快速检测。目的基因有rol抗菌基因、抗几丁质酶基因、抗菌蛋白基因、CHS基因等。

月季遗传转化的方法主要是农杆菌介导法。Firoozababy等(1991)首次成功地进行了农杆菌介导的月季转化。他们以月季一品种(R.hybrida cv.Royalty)为供试材料,将其胚性愈伤与含有pnos NPT II/p35S LUC质粒的致瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404或与含有pnos NPT II/p35SGUS质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenesis) 15834共培养,得到了很高的转化愈伤频率,即每克愈伤约产生40～60个独立的抗卡那霉素愈伤,通过LUC或GUS和PCR技术检测,几乎100%的抗性愈伤为转化愈性。农杆菌菌株及质粒种类对转化影响不大,根癌农杆菌LBA4404 或发根农杆菌15834 的转化效率无显著差异,根癌农杆菌GV3101、EHA105 和GV2260也都有成功报道,但农杆菌的预培养及共培养时间对转化效率有一定影响。Dohm等[9]报道使用根癌农杆菌EHA105 和GV2260 时,摇菌时间不应超过2 h,共培养时间分别为2 d和6 d。共培养的结果是得到了再生的转基因植株。2004年,Kim等[10]将绿色荧光蛋白基因运用农杆菌介导法成功转化月季,并得到Southern 杂交分析验证。以上结果表明农杆菌菌株及质粒种类对转化影响不大,但农杆菌的预培养及共培养时间对转化效率有一定影响。

除农杆菌介导法外,还有基因枪法。Marchant等[11]以胚性愈伤组织细胞为对象,通过转化GUS报告基因,将基因枪法的转化条件进行了优化。此后他又成功地将来自水稻的几丁质酶基因转入月季一品种(R.hybrida ‘Glad Tidings ),使该品种月季黑斑病的发生率降低13%～43%,抗病效果与几丁质酶基因的表达量呈正相关[12]。

目前,月季转基因植株再生方法多用体细胞胚再生。报告基因检测、聚合酶链式反应检测、South杂交法、North杂交法等分子生物学方法用于检测基因是否在转基因月季细胞中存在并表达。之后还要进行生物学鉴定,以确定外源基因能否正常的表达性状,并稳定地遗传给后代。

3展望

近年来在月季和玫瑰的组培和转化方面虽然取得了较大的进展,但只有少数品种建立了高效再生体系,转基因多数还停留在报告基因转化的水平,外源基因在转基因植株中表达和稳定性的报道不多,至今未有在生产中推广的转基因月季和玫瑰品种。而月季原产我国,我们拥有许多优良种质资源和基因资源,对一些具有商业价值的月季品种进行组培再生系统的研究,及应用转基因方法对月季的花色、花期、鲜切花寿命等进行研究,完全可能培育出具有商业价值和有自主知识产权的新月季品种[13]。

参考文献:

[1] 黄善武.月季育种[M]//程金水.园林植物遗传育种学.北京:中国农业出版社,2000:385-401.

[2] 高莉萍,包满珠.月季的植株再生及遗传转化研究进展[J].植物学通报,2005,22(2):231-237.

[3] 郑玉梅,马神,刘青林.月季遗传转化研究进展[J].中国生物工程杂志,2003,23(2):79-82.

[4] Lloyd D,Roberts A V,Short K C. The induction in vitro of adventitious shoots in Rosa[J].Euphytica,1988,37:31-36.

[5] Dubois L A M, De Vries D P. The direct regeneration of advertitious buds on leaf explants of glasshouse grown cut rose cultivars[J].Acta Horticulturae,1996,424:327-331.

[6] Dohm A,Ludwig C,Nehring K,et al. Somatic embryogenesis in roses[J].Acta Horticulturae,2001, 547:341-348.

[7] Kim C K,Chung J D,Jee S O,et al. Somatic embryogenesis from in vitro grown leaf explants of Rosa hybrida L[J].Journal of Plant Biotechnology,2003(5):169-172.

[8] Yokoya K,Walker S,Sarasam V. Regeneration of rose plants from cel1 and tissue cultures[J].Acta Horticulturae,1996,424:333-337.

[9] Dohm A,Ludwig C,Schilling D,et al. Transformation of roses with genes for antifungal proteins[J].Acta Horticulturae, 2001, 547: 27-34.

[10] Kim C K,Chung J D,Park S H,et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Rosa hybrida using the green fluorescent protein (GFP) gene[J].Plant Cell, Tissue and Organ Culture,2004,78:107-111.

[11] Marchant R,Power J B,Lucas J A,et al. Biolistic transformation of rose(Rosa hybrida L.)[J].Annals of Botany,1998,81:109-114.

[12] Marchant R,Davey M R,Lucas J A,et al. Expression of a chitinase transgene in rose(Rosa hybrida L.)reduces development of black disease(Diplocarpon rosae Wolf)[J].Molecular Breeding,1998(4):187-194.

[13] 李美茹,李洪清,孙梓健,等.月季的组织培养和基因转化研究进展[J].广西植物,2003,23(3):243-249.