陶波 杨文瑾

基金项目：2021年甘肃省高等学校创新基金项目“临夏紫斑牡丹籽粕中总黄酮提取纯化工艺及抗氧化性和抑菌活性研究”（2021B-568）。

作者简介：陶波（1989—），男，甘肃张掖人，硕士，讲师。研究方向：动物病理学及中兽药研发。

摘 要：选用D101、AB-8、NKA-9型大孔树脂进行静态吸附及解析性能试验，筛选出AB-8型大孔树脂进行动态试验研究，获得了紫斑牡丹籽粕中总黄酮的最佳纯化工艺条件。结果显示，利用AB-8型大孔树脂在上样液浓度为5 mg·mL-1、pH值为5、流速为3 BV·h-1、上样液体积为5 BV条件下进行吸附，在洗脱液为70%乙醇、洗脱液流速为1.5 BV·h-1、洗脱液体积为7 BV条件下洗脱，纯化后紫斑牡丹籽粕总黄酮含量由8.54%提高到32.36%，该工艺可行性较高，可为紫斑牡丹籽粕中总黄酮纯化提供有效理论依据。

关键词：紫斑牡丹籽粕；总黄酮；大孔树脂；纯化

Study on Purification Process of Total Flavonoids from Paeonia rockii Seed Meal

TAO Bo， YANG Wenjin

（Department of Biotechnology， Linxia Modern Vocational College， Linxia 731100， China）

Abstract： D101， AB-8 and NKA-9 macroporous resins were selected for static adsorption and resolution performance tests， and AB-8 macroporous resin was screened for dynamic tests to obtain the optimal purification process conditions for total flavonoids in Paeonia rockii seed meal. The results show that the AB-8 macroporous resin was used for adsorption under the conditions of sample solution concentration of 5 mg·mL-1， pH value of 5， flow rate of 3 BV·h-1， and sample solution volume of 5 BV， and when the eluent is 70% ethanol， the eluent flow rate is

1.5 BV·h-1， and the eluent volume is 7 BV， the total flavonoid content of purified Paeonia rockii seed meal increases from 8.54% to 32.36%. This process has high feasibility and can provide an effective theoretical basis for the purification of total flavonoids in Paeonia rockii seed meal.

Keywords： Paeonia rockii seed meal; total flavonoids; macroporous resin; purification

紫斑牡丹（Paeonia rockii）既是觀赏性花卉植物，又是重要的药用植物，其花、皮具有一定的活血化瘀、抗病毒、抗菌等药用价值。紫斑牡丹中黄酮类化合物是重要的活性物质[1-2]，现已被广泛研究开发并取得了良好的经济效益[3]。紫斑牡丹籽油中含有较高浓度的α-亚油酸，具有抗氧化、免疫调节、美容防辐射等功效[4]，目前也作为保健食品原料被开发利用[5]，但紫斑牡丹籽粕却成为工业废料而未能有效利用。前期提取工艺试验研究表明，紫斑牡丹籽粕中总黄酮粗提物含量为8.54%，本文旨在研究紫斑牡丹籽粕总黄酮的纯化工艺，为进一步提高紫斑牡丹种子的利用率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫斑牡丹籽粕由临夏河州牡丹农业科技有限公司赠送，烘干粉碎备用。

无水乙醇、石油醚（60～90 ℃）、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠和三氯化铝均为分析纯；芦丁标准品（CAS：153-18-4）；AB-8型树脂、D-101型树脂、NKA-9型树脂，均购自安徽三星树脂有限公司。

1.2 仪器与设备

NBL-124e型电子天平，艾德姆衡有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SUS304中药粉碎机，慈溪丁帅电器公司；SHZ-D2型循环水真空泵，上海力辰邦西仪器设备有限公司；V-5100B型可见分光光度计，元析仪器有限公司；SHA-CA型恒温振荡器，常州润华电器有限公司。

1.3 紫斑牡丹籽粕黄酮提取与测定

（1）紫斑牡丹籽粕预处理。将干燥后的紫斑牡丹籽粕粉碎过筛后装入烧杯，按1∶3（V/V）加入石油醚封口，脱脂1.5 h（3次），至石油醚无色后抽滤干燥待用[6]。

（2）紫斑牡丹籽粕总黄酮粗提物制备。在乙醇浓度76%、提取温度74 ℃、提取时间133 min及料液比1∶36（g∶mL）的条件下提取预处理后的紫斑牡丹籽粕，对总黄酮粗提物溶液进行减压蒸馏，干燥至恒重，获得紫斑牡丹籽粕总黄酮粗提物。

（3）标准曲线绘制。准确称取10.00 mg芦丁标准品置于100 mL棕色容量瓶，以浓度70%乙醇溶解并定容，即得芦丁对照品原液（0.1 mg·mL-1）。准确吸取对照样品原液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、

4 mL和5 mL置于25 mL容量瓶，加入蒸馏水6 mL，

加入5%NaNO2溶液1 mL混匀，反应6 min后加入10% Al（NO3）3溶液1 mL混匀，反应6 min后加入4% NaOH溶液10 mL，以蒸馏水定容至刻度线后混匀，静置显色15 min并在波长510 nm处测定其吸光度，绘制标准曲线[7]。

1.4 大孔树脂纯化工艺单因素试验

1.4.1 大孔树脂预处理

用3 BV的95%乙醇将选用的D101、AB-8、NKA-9 3种型号树脂浸泡24 h，使其充分溶胀，用蒸馏水多次冲洗至流出液清澈无醇味，抽滤后封口备用[7]。

1.4.2 大孔吸附树脂型号选择

准确称取经1.4.1处理的3种型号大孔树脂

1.0 g置于具塞锥形瓶（平行3组），各加入一定量已知浓度紫斑牡丹籽粕總黄酮粗提物溶液，振摇12 h

后取一定量滤液，测定滤液中总黄酮浓度并按公式（1）计算其吸附率；将各锥形瓶中剩余液体过滤并用适量蒸馏水对大孔树脂进行冲洗，吸干水分，各加入50 mL 60%的乙醇振摇12 h，过滤后取一定量滤液，测定解析液中总黄酮浓度并按公式（2）计算其解

析率[8]。

吸附率=（C0-C1）/C0×100%（1）

解析率=C2/（C0-C1）×100%（2）

式中：C0为总黄酮粗提物初始浓度，mg·mL-1；C1为吸附平衡后总黄酮粗提物浓度，mg·mL-1；C2为解析液中总黄酮粗提物浓度，mg·mL-1。

1.4.3 大孔树脂静态吸附性能的考察

（1）上样液浓度对吸附性能的影响。配制浓度分别为0.87 mg·mL-1、1.74 mg·mL-1、2.61 mg·mL-1、

3.48 mg·mL-1、4.35 mg·mL-1、5.22 mg·mL-1、

6.09 mg·mL-1、6.96 mg·mL-1和7.83 mg·mL-1的紫斑牡丹籽粕总黄酮粗提物样品液，向盛有1.0 g AB-8型树脂的锥形瓶中加入上述浓度样品液各50 mL，振摇6 h后过滤，取滤液测定其总黄酮浓度，确定AB-8型树脂的最佳吸附浓度[9]。

（2）上样液pH值对吸附性能的影响。称取1.0 g AB-8型大孔树脂置于具塞锥形瓶中，各加入浓度为5 mg·mL-1样品溶液50 mL（平行3组），分别将各试验组溶液pH值调至3、4、5、6、7，振摇6 h后测定剩余液体总黄酮浓度，确定AB-8型大孔树脂最佳上样液pH值[9]。

（3）上样液流速对吸附性能的影响。取一定体积AB-8型大孔树脂湿法装柱，上样液浓度为

5 mg·mL-1，分别在2 BV·h-1、3 BV·h-1、4 BV·h-1、

5 BV·h-1条件下过柱，每10 mL收集一次漏液并测定总黄酮含量，确定上样液总黄酮最佳吸附流速[9]。

1.4.4 大孔吸附树脂动态吸附及解析性能试验

（1）动态吸附透过试验。取一定量AB-8型大孔树脂湿法装柱，上样液浓度为5 mg·mL-1，以

1 BV·h-1流速过柱，每20 mL收集一次漏出液，测定流出液吸光值并计算其浓度，确定其最大吸附量[10]。

（2）洗脱液浓度及用量对解析效果的影响。选用乙醇溶液作为总黄酮洗脱剂，在洗脱剂流速为

1 BV·h-1下，分别以60%、70%、80%乙醇对吸附饱和的AB-8型大孔树脂进行洗脱，每20 mL收集一次漏出液，测定其吸光度，确定洗脱剂最佳解析浓度及充分洗脱时洗脱剂用量。

（3）洗脱流速对解析效果的影响。用适量蒸馏水对吸附饱和的AB-8型大孔树脂进行冲洗，滤干水分后以70%乙醇在流速为1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1、

2.0 BV·h-1、2.5 BV·h-1进行过柱洗脱，各流速层析柱每20 mL收集一次漏出液，测定其吸光度，确定AB-8型大孔树脂最佳洗脱流速[11]。

1.5 纯化工艺验证

基于上述单因素试验结果选取最佳纯化工艺条件，进行3次平行试验进行验证，测定纯化后紫斑牡丹籽粕总黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程

在510 nm处测定芦丁标准系列溶液，以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为y=8.75x+0.000 7，R2=0.999 6。

2.2 大孔吸附树脂纯化工艺

2.2.1 大孔吸附树脂型号选择

由表1可知，在相同条件下对各型号大孔树脂的吸附及解析性能进行比较，AB-8型大孔吸附树脂吸附及解析性能优于其余2种型号大孔吸附树脂，故选择AB-8型大孔树脂对紫斑牡丹籽粕总黄酮进行纯化。

2.2.2 上样液浓度对吸附性能的影响

由图1可知，AB-8大孔树脂吸附性能在一定范围内随上样浓度增大而增加，当浓度过大时，由于总黄酮杂质吸附沉积于大孔树脂表面导致其吸附性能下降。当上样液浓度在5.22 mg·mL-1时，AB-8大孔树脂吸附性能最佳，为考虑实际生产情况，最终选择上样液浓度为5 mg·mL-1进行吸附。

2.2.3 上样液pH值对吸附性能的影响

由图2可知，上样液pH值对大孔树脂的吸附性能有一定影响，当上样液pH值为5时，AB-8大孔树脂吸附性能最佳。

2.2.4 上样液流速对吸附性能的影响

由图3可知，上样液流速对大孔树脂的吸附性能有一定影响，当上样液流速为2 BV·h-1时，AB-8大孔树脂吸附性能最佳，但考虑到实际生产中流速过慢会提高生成成本，最终选用上样液流速为3 BV·h-1进行总黄酮吸附。

2.2.5 动态透过曲线绘制

由图4可知，当上样液浓度为5 mg·mL-1，上样液体积达到140 mL时，大孔吸附树脂已基本吸附饱和。为减少原料浪费并确保大孔树脂吸附饱和，最终选用上样液体积为150 mL（5 BV）。

2.2.6 洗脱液浓度及用量对解析效果的影响

由图5可知，不同浓度乙醇对总黄酮洗脱作用有所差异，浓度为60%、70%、80%乙醇在用量分别为260 mL、200 mL、180 mL时总黄酮全部析出。为确保完全洗脱并考虑节省生产成本，最终选用浓度为70%的乙醇作为洗脱液，洗脱液用量为210 mL（7 BV）。

2.2.7 洗脱流速对解析效果的影响

由图6可知，随洗脱液流速增加，洗脱液对总黄酮解析效果下降，为保证解析效果及提高生产效率，最终选用洗脱液流速为1.5 BV·h-1对总黄酮进行解析。

2.3 验证试验结果

根据单因素试验结果确定最佳纯化工艺条件为上样液浓度为5 mg·mL-1、上樣液pH值为5、上样液流速为3 BV·h-1、上样液体积为5 BV条件下利用AB-8型大孔树脂进行吸附，以70%乙醇在流速

1.5 BV·h-1、体积7 BV条件下进行洗脱，按照此条件进行总黄酮纯化并测定其含量，进行3次平行试验。结果表明，纯化后紫斑牡丹籽粕总黄酮含量达到32.36%。

3 结论

试验选择D101、AB-8、NKA-9型3种大孔树脂对总黄酮进行吸附及解析，筛选出性能较好的AB-8型大孔树脂进行紫斑牡丹籽粕总黄酮纯化工艺研究。结果表明，紫斑牡丹籽粕总黄酮在上样液浓度为5 mg·mL-1、上样液pH值为5、上样液流速为3 BV·h-1、上样液体积为5 BV条件下进行吸附，以70%乙醇在流速1.5 BV·h-1、体积7 BV条件下进行洗脱，紫斑牡丹籽粕总黄酮含量由8.54%提高到32.36%，该工艺安全可靠，具有较好的实际应用价值，可为工业生产提供有效理论依据。

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