安微 林华 郑晶 李丹丹 张婧 徐国锋

基金项目：海关总署科研项目（2021HK174）。

作者简介：安微（1986—），女，黑龙江讷河人，硕士，高级兽医师。研究方向：动物疫病检测。

通信作者：徐国锋（1986—），男，山东聊城人，博士，助理研究员。研究方向：动物病原体检测。E-mail： xgf879@163.com。

摘 要：本研究以对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）的VP664基因、传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious Subcutaneous and Hematopoietic Necrosis Virus，IHHNV）的NSP2基因、虾肝肠胞虫（Enterocytozoon Hepatopenaei，EHP）的ssrRNA基因以及坏死性肝胰腺炎细菌（Necrotizing Hepatopancreatitis Bacteria，NHPB）的16SrRNA基因为检测对象，建立了WSSV、IHHNV、EHP和NHPB的四重荧光定量PCR方法，并对该方法的特异性、灵敏性进行了研究。结果表明，建立的四重荧光定量PCR方法特异性良好，对WSSV、IHHNV、EHP和NHPB的最低检测限为4.05 copies·μL-1、6.53 copies·μL-1、

5.85 copies·μL-1和6.18 copies·μL-1，本实验建立的方法具有较好的应用前景。

关键词：对虾；对虾白斑综合症病毒（WSSV）；传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）；虾肝肠胞虫（EHP）；坏死性肝胰腺炎细菌（NHPB）

Establishment of Quadruple-Fluorescence Quantitative PCR Detection Method for WSSV， IHHNV， EHP and NHPB

AN Wei1， LIN Hua1， ZHENG Jing1， LI Dandan2， ZHANG Jing1， XU Guofeng3*

（1.Technical Center of Chengdu Customs， Chengdu 610041， China;

2.Technical Center of Haikou Customs， Haikou 570100， China;

3.Inflammation and Allergic Diseases Research Unit， Affiliated Hospital of Southwest Medical University，

Luzhou 646000， China）

Abstract： This study focuses on the VP664 gene of WSSV in shrimp， the NSP2 gene of IHHNV， the ssrRNA gene of EHP， and the 16SrRNA gene of NHPB. A quadruple fluorescence quantitative PCR method was established to simultaneously detect WSSV， IHHNV， EHP， and NHPB， and the specificity and sensitivity of this method were studied. The experimental results indicate that the established quadruple fluorescence quantitative PCR method has good specificity， with the minimum detection limits for WSSV， IHHNV， EHP， and NHPB being 4.05 copies·μL-1，

6.53 copies·μL-1， 5.85 copies·μL-1 and 6.18 copies·μL-1. The method established in this experiment has good application prospects.

Keywords： shrimp; white spot syndrome virus（WSSV）; infectious subcutaneous and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）; enterocytozoon hepatopenaei（EHP）; necrotizing hepatopancreatitis bacteria（NHPB）

我国是世界上对虾消费量最大的国家之一，对虾在我国消费者的餐桌上占据着重要的地位，因此保障对虾的食品安全问题至关重要[1]。随着我国对虾养殖规模的不斷扩大，再加上目前养殖户普遍采用养殖密度高、集约化的养殖模式，使得养殖水环境恶化，各类对虾传染性疾病频发，严重威胁了我国对虾产业的可持续发展[2]。对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）、传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious Subcutaneous and Hematopoietic Necrosis Virus，IHHNV）、虾肝肠胞虫（Enterocytozoon Hepatopenaei，EHP）以及坏死性肝胰腺炎细菌（Necrotizing Hepatopancreatitis Bacteria，NHPB）是对虾养殖中最常见的4种病原菌，对对虾养殖业产生巨大的危害[3-4]。

在对收集的对虾样本进行常见病原菌检测时发现，WSSV、IHHNV、EHP和NHPB在临床样本中容易发生细菌、病毒混合感染的情况，这增加了临床诊断的难度，所以迫切需要一种能够同时检测4种病原菌的方法，以便快速、准确地进行诊断。本研究将通过优化PCR反应条件、引物设计和探针选择，建立一种同时针对这4种病原体进行定量PCR检测的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

WSSV、IHHNV、EHP、NHPB、肝胰腺细小病毒（Hepatopancreatic Parvovirus，HPV）、急性肝胰腺坏死病毒（Acute Hepatopancreas Necrosis，AHPND）、十足目虹彩病毒1（Decapod Iridescent Virus 1，DIV1）和虾血细胞虹彩病毒（Shrimp Hemocyte Iridescent Virus，SHIV）均为本实验室保存。

1.2 试剂

基因组DNA提取试剂盒、AceQ qPCR Probe Master Mix、胶回收/DNA纯化试剂盒、ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2和快速质粒小提试剂盒。

1.3 引物探针设计与合成

本试验以WSSV的VP664基因、IHHNV的NSP2基因、EHP的ssrRNA基因以及NHPB的

16SrRNA基因为检测对象，分别设计4对特异性引物和探针；多重荧光定量PCR引物、探针由成都擎科伟业生物技术有限公司合成，序列如表1所述。

1.4 构建质粒标准品

参照基因组提取试剂盒说明提取DNA，使用本试验设计的普通PCR引物扩增目标基因，运用胶回收/DNA纯化试剂盒纯化目标基因，运用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V2构建重组质粒，经测序比对成功后作为标准品备用。按照常规方法扩增含有标准品质粒的阳性菌株，运用快速质粒小提试剂盒提取标准品，按照计算公式得出质粒标准品的拷贝数[5]。

1.5 建立标准曲线

按照已经筛选、优化后的PCR反应条件和反应参数，将WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的质粒标准品进行梯度稀释（10倍），选择其中8个稀释度浓度，建立标准曲线，计算标注曲线相关系数R2及效率E。

1.6 特异性试验

以WSSV、IHHNV、EHP、NHPB、HPV、AHPND、DIV1、SHIV的cDNA/DNA为模板，验证所建立方法的特异性。

1.7 灵敏性试验

将WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的质粒标准品进行梯度稀释（10倍），采用106～10-1 copies·μL-1

共8个浓度，用来验证该方法的灵敏性，确定最低检出限。

2 结果与分析

2.1 重组质粒标准品

参照表1所述的引物，扩增4种病原菌的DNA，扩增产物大小分别为69 bp、81 bp、156 bp和67 bp。运用ClonExpress Ultra One Step Cloning

Kit V2与各个DNA片段构建重组质粒，经过计算得出WSSV、IHHNV、EHP、NHPB质粒标准品的拷贝数为4.05×1010 copies·μL-1、6.53×1010 copies·μL-1、

5.85×1010 copies·μL-1和6.18×1010 copies·μL-1。

2.2 标准曲线的建立

WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的引物浓度分别为0.4 μL、0.5 μL、0.6 μL和0.6 μL；探针浓度分别为0.3 μL、0.4 μL、0.4 μL和0.2 μL；荧光通道分别为CY5、VIC、Texas Red和6-FAM；反应体系为20 μL。反应程序为95 ℃下5 min；95 ℃下10 s，

62 ℃下30 s，循环40次。本试验的判断标准是Ct值≤35，扩增曲线呈“S”型，则检测结果为阳性；当35

2.3 特异性结果

该方法只对WSSV、IHHNV、EHP和NHPB有特異性扩增，对HPV、AHPND、DIV1和SHIV呈现出阴性检测结果，表明该方法具有良好的特异性。

2.4 灵敏性结果

为了验证建立方法的灵敏性，选择不同稀释度的质粒标准品进行扩增反应，结果见图1。本试验建立的多重荧光定量PCR方法对WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的最低检测限分别为4.05 copies·μL-1、

6.53 copies·μL-1、5.85 copies·μL-1和6.18 copies·μL-1，

表现该方法具有较高的灵敏性。

3 结论与讨论

近年来，随着我国对对虾的需求量逐渐增多，对虾养殖业迎来了蓬勃发展，大规模、高密度的养殖模式使得水环境遭到破坏，各类对虾疾病频发。据报道，对虾疾病约有60%是由病毒引起，其次是细菌和寄生虫，而且由病毒、细菌、寄生虫引起的混合感染在对虾临床上也呈现出逐年增多趋势[6]。本文成功建立了一种WSSV、IHHNV、EHP和NHPB四重荧光定量PCR检测方法。该检测方法涵盖了引起对虾疾病常见的病毒、细菌和寄生虫，本方法的建立旨在解决现有单一或双重PCR方法的局限性，并提供一种高效、快速和可靠的多重病原体检测方案。本次建立的方法具有良好特异性，只对WSSV、IHHNV、EHP和NHPB有特异性检测结果，对其他病原菌呈现阴性检测结果。本方法灵敏度高，对WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的最低检测限都小于10 copies·μL-1，想较于其他检测方法优势明显[7]。虽然本文已经成功地应用于WSSV、IHHNV、EHP、NHPB的临床检验，但在面对其他新出现的病原体或其变异株时，可能需要进一步改进和验证该方法的特异性和准确性。此外，还需要考虑实际操作的可行性和成本效益等因素。

参考文献

[1]陆冬.山东省南美白对虾养殖产业发展现状与对策研究[D].厦门：集美大学，2022.

[2]于永翔，王印庚，蔡欣欣，等.环境、病原、免疫因子三要素与池塘养殖对虾AHPND发生的关联性[J].水生生物学报，2023，47（1）：1-10.

[3]刘宝彬，杨冰，吕秀旺，等.凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）及虾肝肠胞虫（EHP）的荧光定量PCR检测[J].渔业科学进展，2017，38（2）：158-166.

[4]李家侨，谢艳辉，李家婵，等.湛江口岸进口冻虾携带病毒检测发现与分析[J].中国口岸科学技术，2021，3（5）：38-44.

[5]安微，郑晶，车颖欣，等.诺如病毒和轮状病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立[J].中国兽医杂志，2022，58（8）：49-54.

[6]刘顺，翁歆之，郑晓叶，等.2017年—2019年浙江台州地区凡纳滨对虾4种病原PCR检测[J].动物医学进展，2022，43（3）：137-141.

[7]QIU L，CHEN M M，WAN X Y，et al.Detection and quantification of shrimp hemocyte iridescent virus by TaqMan probe based real-time PCR[J].J Invertebr Pathol，2018，154（5）：95-101.