苏章轩，刘潇潇，张恺东，陆 佳

（广东省药品检验所，广东广州 510180）

龙泽熊胆胶囊由龙胆、黄连、黄芩、防风等17 味中药材组成，有清热散风、止痛退翳功效，临床用于治疗风热或肝经湿热引起的目赤肿痛、羞明多泪［1］。龙泽熊胆胶囊现行标准收载于2020 年版《中国药典（一部）》，其中鉴别项目以当归、栀子、防风、黄连为对照药材，阿魏酸、栀子苷、盐酸小檗碱、熊去氧胆酸为对照品进行薄层色谱（TLC）鉴别，但在检验中发现，防风的TLC 鉴别方法存在色谱拖尾严重、专属性不强等问题，严重影响对样品结果的判定。而在含量测定项中，现行标准仅对龙胆苦苷的含量进行测定，指标偏少。鉴于防风质量控制方法专属性不强，且药材来源较混乱的现状［2-5］，存在部分企业误投少投的可能，本研究中对防风特征性成分升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇进行TLC鉴别及含量测定［6-10］，为进一步完善和优化制剂的质量标准提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC - 20AT 型高效液相色谱仪（日本Shimadzu 公司），含SPD-M20A型二极管阵列检测器；KQ-300DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP224S 型和CP225D 型电子天平（德国Sartorius 公司，精度均为0.01 mg）。

1.2 试药

龙泽熊胆胶囊（20 批，广东省药品检验所抽检样品，来自11个生产厂家，样品信息见表1，其中，样品1-9分别来自厂家a-I，样品10-20均来自厂家k）；防风对照药材（中国食品药品检定研究院，批号为120947 -201810）；升麻素对照品（批号为AF21092804，含量98.0%），5 -O- 甲基维斯阿米醇对照品（批号为AF20100511，含量98.0%），均购于成都埃法生物科技有限公司；预制硅胶G 薄层板（德国Merck 公司，青岛海洋化工厂分厂）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

2.1.1 方法建立

称取样品内容物2.5 g，加乙醇50 mL，加热回流30 min，冷却至室温，滤过，滤液蒸干，残渣加氨试液10 mL 使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取3 次（20，20，10 mL），合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水20 mL洗涤，取正丁醇液蒸干，残渣加乙醇4 mL 使溶解，加在中性氧化铝柱上（100～200目，3 g，内径为1.0～1.5 cm），用乙醇100 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇10 mL 使溶解，即得供试品溶液；取升麻素、5 -O- 甲基维斯阿米醇对照品各适量，加甲醇制成每1 mL 各含1 mg的单一对照品溶液；取防风对照药材0.5 g，加甲醇20 mL，超声（功率300 W，频率40 kHz）处理20 min，滤过，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，即得对照药材溶液；按龙泽熊胆胶囊处方及工艺制备缺防风的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。将硅胶G薄层板于105 ℃活化20 min，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯- 乙酸乙酯- 丙酮（2∶4∶3，V/V/V）为展开剂，预饱和20 min，取出，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加热1 min，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱和对照药材溶液色谱相应位置均显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。

2.1.2 耐用性考察

展开温度：取上述溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，保持相对湿度为65%，分别置4 ℃和25 ℃下展开，按拟订展开方法操作，结果见图1。可见分离效果在2 种温度下无明显差异，表明本方法在不同温度条件下适应性均较好。

1 - 9. 供试品溶液（样品1 - 9） 10. 对照药材溶液 11. 升麻素对照品溶液 12.5 - O - 甲基维斯阿米醇对照品溶液13. 阴性对照品溶液A.25 ℃ B.4 ℃图1 展开温度考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.25 ℃ B.4 ℃Fig.1 Investigation of temperature

展开湿度：取上述溶液各5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，保持展开温度为25 ℃，分别在相对湿度32%和88%的展开缸内展开（展开缸内提前用不同比例的硫酸- 水混合液调节相对湿度），按拟订展开方法操作，结果见图2。结果相对湿度为88%时比移值较小，但并未影响分离与鉴别效果。

1 - 9. 供试品溶液（样品1 - 9） 10. 对照药材溶液 11. 升麻素对照品溶液 12.5 - O - 甲基维斯阿米醇对照品溶液13. 阴性对照品溶液A.32% B.88%图2 展开湿度考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.32% B.88%Fig.2 Investigation of humidity

硅胶G 薄层板：取上述溶液各5 μL，保持展开温度为25 ℃，相对湿度为65%，点于2 个厂家的硅胶G 薄层板上，按拟订展开方法操作，结果见图3。结果2 个厂家的硅胶G薄层板的分离效果差异不大，故本方法对薄层板的品牌无特殊要求。

1 - 9. 供试品溶液（样品1 - 9） 10. 对照药材溶液 11. 升麻素对照品溶液 12.5 - O - 甲基维斯阿米醇对照品溶液13. 阴性对照品溶液A. 德国Merck公司 B. 青岛海洋化工厂分厂图3 不同硅胶G薄层板考察1 - 9.Test solution（samples 1 - 9） 10.Medicinal materials reference solution 11.Cimifugin reference solution 12.5 - O - methylvisamminol reference solution 13.Negative reference solutionA.Merck Company from Germany B.Qingdao Ocean Chemical Plant BranchFig.3 Investigation of different silica gel G plates for TLC

2.1.3 鉴别

按拟订的TLC 方法，对k 厂生产的11 批样品进行检测，结果未检出防风的特征斑点，详见图4。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Wondasil C18柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脱（0～25 min 时5%A →20%A，25～30 min时20%A →25%A，30～50 min时25%A →40%A，50～51 min 时40%A →90%A，51～70 min 时90%A，70～71 min 时90%A →5%A，71～85 min时5%A）；流速：0.8 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2.2 溶液制备

分别称取升麻素、5-O-甲基维斯阿米醇对照品各适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含升麻素50 μg、5 -O- 甲基维斯阿米醇25 μg 的混合对照品溶液。按2.1.1项下方法制备供试品溶液和阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2.2 项下3 种溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。详见图5。

线性关系考察：取升麻素对照品0.0104 1 g、5-O-甲基维斯阿米醇对照品0.010 18 g，精密称定，加甲醇制得每1 mL 分别含1 020 μg和998 μg的单一对照品贮备液，分别精密吸取2，1 mL，加甲醇制成每1 mL含升麻素102 μg、5-O-甲基维斯阿米醇50 μg的系列混合对照品贮备液，分别精密吸取0.5，1，2，5，8，10 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以待测成分进样量（X，ng）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y1= 3 782 748.389X1+4 207.351（R2= 1.000），Y2= 3 178 861.258X2+1 202.569（R2=1.000）。结果表明，升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇进样量分别在0.051～1.020 μg 和0.025～0.499 μg范围内与峰面积线性关系良好。

检测限与定量限考察：取2.2.2项下混合对照品溶液适量，逐级稀释，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以信噪比（S/N）为3.0和10.0时待测成分的质量浓度分别为检测限和定量限。结果升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇的检测限均为0.1 μg/mL，定量限均为0.3 μg/mL。

精密度试验：取“线性关系考察”项下系列混合对照品贮备液适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。结果升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇峰面积的RSD分别为1.12%和1.20%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（编号2）适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，1，3，6，10，12，24 h 时按2.2.1 项下色谱条件进样测定。结果升麻素和5 -O- 甲基维斯阿米醇峰面积的RSD分别为1.21%和0.96%（n= 7），表明供试品溶液在室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品（编号2）适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，平行6份，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇含量的RSD分别为0.42%和1.24%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（编号2）内容物2.5 g，精密称定，各6 份，加入系列混合对照品贮备液1 mL（每1 mL含升麻素102 μg、5-O-甲基维斯阿米醇50 μg），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.2.4 样品含量测定

取样品各适量，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，平行3 次，记录峰面积。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（µg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of cimifugin and 5 - O -methylvisamminol in samples（µg / g，n = 3）

3 讨论

龙泽熊胆胶囊现行标准中防风的TLC 鉴别方法分离效果差，并缺乏对防风的定量控制。鉴于此，本研究中优化了现行标准中防风的TLC鉴别方法［11］，并对不同展开温度、相对湿度、硅胶G薄层板进行了考察，结果发现，本研究中建立的方法适用性较好，且均对结果无干扰。同时，针对该复方中升麻素和5-O-甲基维斯阿米醇的定量分析填补了制剂中防风含量测定的空白［12-13］。

采用本研究中所建立的方法对样品进行含量测定时，发现升麻素和5 -O- 甲基维斯阿米醇仅在厂家k样品中未检出，故对该厂家样品存疑，其有效物质成分的显著差异可能对该药品的有效性、安全性及临床疗效有较大影响。其原因可能为：1）生产企业为降低成本未按处方投料或少投料［14］；2）防风的地方习用品及栽培品较多，如水防风［15］、陕防风、川防风等，生产企业使用其他防风掺伪投料，或生产企业药材鉴定水平较低，存在误买误用情况；3）原标准TLC 图谱存在拖尾现象，导致企业误判。

综上所述，本研究中所建立的方法专属性强，耐用性、重复性好，可发现该品种防风少投料误投料等问题，能有效控制龙泽熊胆胶囊的质量。