任 鹏,商 艳,袁良喜

(1.海军军医大学第一附属医院全科医学科,上海 200433; 2.海军军医大学第一附属医院血管外科,上海 200433)

当前临床上糖尿病足溃疡的治疗主要包括微创清创术、血运重建术以及伤口敷料、负压创面治疗、抗生素抗感染、生长因子、干细胞和皮肤替代品在内的治疗手段,并成为预防截肢的重要工具[3]。然而,传统敷料功能单一,需要频繁更换;长期反复清创给患者带来极大的痛苦和巨大的经济负担。此外,耐药微生物的出现使抗生素治疗效果不佳[4-6]。基因治疗、生长因子治疗和干细胞治疗等辅助治疗逐渐在临床上被重视。然而,体内蛋白酶会导致这些物质在人体内半衰期短和药物清除率增加[7],并且具有对组织或器官有毒,药物递送不受控制,剂量不足或过量以及对机体产生免疫反应等缺点[8]。因此,目前糖尿病足溃疡的临床治疗效果并不令人满意,这促使研究人员将注意力转向先进的纳米技术。

1 糖尿病足溃疡创面愈合的特点

2 糖尿病足溃疡纳米材料治疗进展

近年来,纳米技术成为糖尿病患者及其相关并发症治疗的研究热点之一。纳米颗粒是纳米范围内的颗粒,可以作为一个单一的实体,具有不同的大小和形态[11]。在伤口愈合阶段,纳米颗粒是局部递送的理想选择,支持与生物靶点更好地相互作用,并增加伤口部位的渗透。纳米颗粒保护药物不被酶降解,增加药代动力学,防止药物泄漏到预期位置以外的任何其他位置,而不会对正常细胞本身产生太大影响。外周动脉疾病、神经病变、炎症因子的持续释放和感染是影响糖尿病足溃疡发展的关键因素。本文介绍基于糖尿病足溃疡发病的病理生理及细胞分子基础的纳米疗法的研究进展。

2.1 改善周围神经病变的纳米材料

2.1.1 降低溃疡创面血糖 高血糖是影响糖尿病足溃疡神经病变的主要因素,神经病变严重程度与暴露于高血糖的持续时间和严重程度影响呈正相关。降低血糖有利于减轻患者神经病变的进展,以减轻疼痛,提高生活质量。然而,大多数药物的生物利用度低且治疗效果不佳。基于纳米材料调节药物释放以提高生物利用度的能力,在纳米载体中负载降糖药物是降低糖尿病足创面血糖的有效方法之一。Liang等[12]研制出pH/葡萄糖双响应性二甲双胍缓释水凝胶敷料,实现了二甲双胍在高血糖创面环境中的释放,降低小鼠溃疡创面血糖并减弱创面炎症,促进胶原沉积和创面愈合。Lee等[13]研制了可降解纳米纤维二甲双胍洗脱膜,能够释放高浓度的二甲双胍超过3周。与对照组相比,该膜改善了糖尿病大鼠的伤口愈合和上皮再形成。除了负载降糖药物,胰岛素、葡萄糖氧化酶、酵母提取物等也被装入纳米系统作用于糖尿病小鼠模型的研究,能够显著降低小鼠血糖水平[14-17]。植物源性植物化合物或其衍生物也被装载成为绿色合成纳米药物,莫哈格大学理学院采用超声辅助法制备了一种重要药用植物水豆瓣菜(旱金莲)的叶提取物,并通过联合超声微波辅助程序用于制备ZnO纳米颗粒,结果显示豆瓣菜叶提取物凭借其植物化学成分对糖尿病大鼠具有显著的降血糖作用[18]。

2.1.2 靶向背根神经节 高血糖常引起背根神经节中电压门控钠通道的上调。背根神经节中钠通道开放频率增加使细胞内钠离子水平升高,进一步导致钙通道开放增加,并刺激其他途径导致糖尿病周围神经病变[19]。背根神经节参与产生外周血小板活化因子、炎症和神经性疼痛[20]。许多药物应用于背根神经节的对症治疗,但由于作用部位的药物传递不足,导致效果不佳[21]。纳米颗粒具有显著而独特的机械化、化学和光学特性,是治疗糖尿病周围神经病变的理想药物。一项研究表明,CeO2(二氧化铈)纳米颗粒在抗氧化损伤中发挥重要作用,并对糖尿病神经病变表现出保护作用,是抑制糖尿病神经损伤的优良药物[22]。Kobyliak等[23]用二氧化铈纳米颗粒治疗神经性糖尿病足溃疡患者,表现出良好的疗效。P2X3受体过表达在周围神经病变中起关键作用[24]。Jia等[25]研究发现负载大黄素的纳米颗粒降低了2型糖尿病背根神经节中ERK1/2的磷酸化和活化,显著抑制转染P2X3受体的HEK293细胞中P2X3激动剂α,β-meATP激活的电流。因此,纳米大黄素治疗通过减少2型糖尿病大鼠背根神经节P2X3受体介导的兴奋性传递来减轻周围神经损伤。背根神经节病变导致的糖尿病足创面神经元损伤是影响其愈合的重要病理生理机制,靶向背根神经节的纳米材料研究在促进糖尿病足溃疡创面愈合上有巨大潜在价值。

2.2 改善周围血管病变的纳米材料

2.2.1 促进NO释放 在伤口愈合过程中,内源性一氧化氮(nitric oxide,NO)合成已被证明具有抑制炎症、促进血管生成和刺激胶原沉积的作用[26]。于是Zhang等[26]引入了一种铜基金属有机骨架,即HKUST-1(Hongkong University of Science and Technology-1)作为NO加载载体,并通过静电纺丝方法设计了一个具有核壳结构的NO持续释放系统。通过研究表明可降解的HKUST-1释放的额外铜离子与NO协同作用,促进内皮细胞生长,显著改善创面血管生成、胶原沉积和抗炎性能,最终加速糖尿病创面愈合。s-亚硝基谷胱甘肽(S-Nitroso-gluta-thione,GSNO)成为治疗皮肤伤口感染的有效药物,然而其高亲水性和可降解性使制备含GSNO纳米颗粒一直具有挑战性。Lee等[27]将亲水性GSNO与疏水性聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)共价结合,使得GSNO在纳米颗粒制备过程中的损失最小化,从而获得足够的负载效率(GSNO为2.32%,NO为0.07 μmol/mg),合成的GSNO-共轭聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)显著促进了小鼠创面愈合。有关促进一氧化氮释放纳米材料的研究已趋于成熟,在促进创面血管生成加速创面愈合方面表现出潜在优势。

2.2.3 调节HIF-1/VEGF轴 创面愈合是一个系统的、动态的过程,涉及到上皮化、血管生成、肉芽组织形成和创面收缩,所有这些过程都受缺氧诱导因子1-α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)调控[29]。在正常组织中,HIF-1α的稳态水平较低,这是由于脯氨酸羟化酶结构域蛋白对HIF-1α的氧依赖性羟基化所致。糖尿病足溃疡患者中HIF-1α靶基因表达受到抑制,因此恢复HIF-1α表达是改善糖尿病足溃疡愈合的关键之一。Yang等[30]研究了一种智能近红外触发的NO纳米发生器(SNP@MOF-UCNP@ssPDA-Cy7/IR786s,缩写为SNP@UCM),该研究发现SNP@UCM与对照处理相比,近红外照射显著促进了VEGF mRNA和蛋白质的表达。SNP@UCM近红外照射处理的人脐静脉内皮细胞培养上清液中VEGF的浓度从257.1 pg/mL显著增加到458.2 pg/mL,HIF-1α蛋白水平较对照组增加约4倍。而且HIF-1α的敲除不仅消除了SNP@UCM近红外照射诱导迁移能力,也降低了VEGF的表达。SNP@UCM在近红外辐射下,通过抑制泛素化介导的HIF-1α与E3泛素连接酶的相互作用来抑制其蛋白酶体降解。SNP@UCM通过增强伤口部位的血管生成、促进血管内皮生长因子(VEGF)的分泌以及细胞增殖和迁移来促进创面愈合[30]。HIF-1/VEGF轴的调节对于糖尿病足局部溃疡创面血管的恢复是一个关键的节点,基于此发病机制的相关纳米材料研究也将更加深入。

2.3 调节炎症反应的纳米材料

2.3.2 促进 Keap1产生、减少Nrf2糖尿病慢性高血糖导致ROS失衡和Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)过度产生,导致调节糖尿病氧化应激的核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)降解[34-35]。在伤口修复过程中各种ROS解毒酶和其他细胞保护蛋白发挥了重要作用,然而这些基因的表达许多都受到Nrf2转录因子的调控[34]。Lin等[36]研究了合成的四面体核酸框架(tetrahedral framework nucleic acid,tFNAs)在糖尿病伤口愈合过程中血管生成过程中的作用及其潜在机制,研究发现在糖尿患者脐静脉内皮细胞中的ROS水平和与氧化损伤和炎症相关的基因表达被tFNAs减弱,在用tFNAs治疗的糖尿患者脐静脉内皮细胞中,p-Akt/总Akt比率、Nrf2水平和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)水平更高。体内实验表明,tFNAs通过加速血管形成、上皮化、胶原沉积和胶原排列来促进糖尿病伤口愈合。

2.3.3 调节ROS失衡 由于活性氧(reactive ox-ygen species,ROS)和炎症因子等有害因子的产生延长了糖尿病创面损伤的恢复时间,因此减轻糖尿病创面微环境中氧化应激和炎症反应有利于糖尿病伤口的愈合。因此,Qi等[37]制备了热可逆的、基于沸石的抗菌纳米颗粒负载水凝胶,通过中和炎症细胞因子和活性氧等有害因素来促进糖尿病伤口愈合。并通过研究证明沸石纳米颗粒协同消除线粒体ROS,中和游离炎症因子,重塑创面抗炎微环境,促进血管生成。Xu等[38]合成了基于伤口敷料的普鲁士蓝纳米颗粒(prussian blue nanoparticles,PBNPs)水凝胶,由于PBNPs能够模拟过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,因此能够有效清除ROS。在体外氧化应激的背景下,这些PBNP能够防止细胞毒性,保护线粒体免受氧化应激相关损伤。应用于小鼠创面后能够改善糖尿病伤口愈合,促进血管生成,并降低糖尿病伤口内促炎IL-6和TNF-α水平。有关ROS相应的纳米材料一直以来是糖尿病足纳米药物研究的热点,同时也具备更深层次的研究空间。

2.4 控制伤口感染的纳米材料

2.4.1 根除生物膜 糖尿病足溃疡创面容易有致病菌定植,包括葡萄球菌、链球菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌[39]。当细菌形成生物膜时,细胞被嵌入一种自产的聚合物基质中,这使它们免受宿主免疫系统和抗生素的保护[40]。因此,尽管进行了全身抗生素治疗,糖尿病足中的生物膜的存在导致愈合延迟和随后慢性感染[41]。最近,利用纳米颗粒根除或控制生物膜的潜力已经得到了证实。Liu等[42]研究了具有共轭抗菌剂的聚(乙烯)乙二醇-聚(β-氨基酯)(PEG-PAE)胶束,它可以独特地穿透生物膜,一旦进入生物膜的低pH环境,就会靶向细菌细胞表面,并通过细菌脂肪酶降解其与PAE的酯链释放共轭抗菌剂。Xu等[43]提出了一种基于二维压电纳米材料的声催化氢/空穴组合“内外协同”钛-生物膜的概念,其中声催化产生的H2和空穴分别快速渗透到生物膜中以抑制细菌能量代谢和氧化剥夺生物膜中的环溶糖/NADH以破坏细菌膜/电子传输链,内外协同根除生物膜。研究中建立了细菌感染的糖尿病伤口模型,证实了声催化氢/孔联合治疗具有良好的体内抗菌性能,显著改善了细菌感染糖尿病伤口的愈合。随着抗杀菌剂生物膜形成生物的出现,新的纳米颗粒策略为破坏和灭活生物膜细胞提供理想的解决方案,从而最大限度地减少杀菌剂或抗生素的使用。

2.4.2 降低基质金属蛋白酶(matrix metallopro-teinase,MMP)表达 MMP在正常生理功能中发挥作用,如发育和重塑。在感染过程中,T细胞活化可诱导MMP-2和MMP-9的表达,而T细胞迁移则由MMP-9介导。感染期间过量的MMP活性会导致宿主的组织损伤[44]。而MMP-9的基因消融增强了糖尿病伤口愈合,从而证实了MMP-9的有害作用[45]。Krishnan等[46]利用短芽孢杆菌KN8(2)的培养滤液合成AgNPs,其研究结果表明,除了抗菌活性外,生物源性AgNPs降低了糖尿病小鼠受伤肉芽组织中MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达,从而促进伤口早期愈合。

2.4.3 改善创面pH 糖尿病足的pH环境一般范围广泛的动态过程,与不同微生物的定殖、发病时间、严重程度、创面阶段等多种因素有关。因此,根据pH变化的多样性,Du等[47]提出了一种pH可切换的纳米酶级联催化(pH-switchable nanozyme cascade catalysis,PNCC)策略,用于调节病理性伤口微环境,以挽救糖尿病足中停滞的愈合。PNCC是通过使用临床批准的氧化铁纳米颗粒包被葡萄糖氧化酶(Fe3O4-GOx)外壳的纳米酶来制作的。Fe3O4-GOx具有内在的葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOx)、过氧化氢酶(catalase,CAT)和过氧化物酶(peroxidase,POD)样活性,可以分别在酸性和中性环境下催化pH可切换的葡萄糖引发的GOx/POD和GOx/CAT级联反应。具体来说,GOx/POD级联反应产生连续的有毒羟基自由基通量,在空间上靶向酸性生物膜,并清除生物膜,缩短炎症期,启动正常的伤口愈合过程。

3 结 语

基于纳米颗粒的治疗方法凭借其更大的疗效和特异性,与更少的系统副作用,在促进创面血管增生、神经修复、抑制炎症反应和抗感染方面表现出巨大的潜力。然而,现有的纳米材料在治疗糖尿病足溃疡方面仍有些局限性:(1) 作用途径单一,联合局部用药与全身给药方面研究薄弱。(2) 治疗仅局限在伤口愈合的某个阶段,创新的纳米材料需要调节伤口愈合的各个阶段,具有抗菌性能、促进组织修复性能、自愈性能、优异的机械性能和伤口敷料的黏附能力,将提高临床应用的性能。(3) 纳米颗粒引起的不良生物效应应该进一步研究,纳米颗粒疗法的发展应该在考虑纳米安全问题的情况下谨慎进行。因此,这些研究方向是未来该领域研究人员的重要研究方向。努力提高纳米颗粒伤口治疗的疗效应该与研究基于纳米颗粒的治疗的长期和短期效果以及支持它们的机制同时进行。目前利用纳米技术治疗糖尿病伤口愈合的方法正以指数速度出现,这一新兴领域的进一步研究和发展将对伤口再生治疗产生积极影响。因此,基于纳米技术的疗法很可能成为下一个突破的前沿,以满足慢性伤口愈合的临床需求。