顾天舒,梁 雪,蔡嘉庚,李广平

(1.天津市心血管病离子与分子机能重点实验室 天津医科大学第二医院心脏科 天津心脏病学研究所,天津 300211;2.北京大学第三医院心内科 血管医学研究所 卫生部心血管分子生物学与调节肽重点实验室 分子心血管学教育部重点实验室 心血管受体研究北京市重点实验室,北京 100191)

N6-甲基腺苷 (N6-methyladenosine,m6A) 是20世纪70年代发现的真核mRNA上最丰富的内部表观修饰,它是在腺苷的N6位点上添加一个由S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosyl methionine,SAM) 提供的甲基基团的一种表观遗传修饰[1]。在7000多个人类基因的转录本中,已鉴定出12000多个典型m6A位点[2]。m6A修饰可以促进mRNA剪接、翻译起始和衰减的关键步骤的进行[3],在RNA代谢的各个方面发挥着基础性作用。最近在动物、细胞模型及人类样本水平上的研究揭示了m6A修饰在心血管功能稳态方面的关键作用。提示m6A可能是心血管疾病 (cardiovascular disease,CVD)潜在的生物标志物和治疗靶点。全面了解m6A在CVD中的调控复杂性,将有助于我们了解CVD的发病机制。本文就m6A对CVD的调控作用做一综述。

1 m6A RNA甲基化

m6A甲基化在编码RNA (如mRNA) 和非编码RNA (如rRNA、tRNA、小核RNA和环状RNA) 上均有表达[4]。催化m6A甲基化的蛋白质成分被称为甲基转移酶或m6A书写器,能够识别这种甲基化的蛋白质家族被称为甲基化阅读蛋白或m6A阅读器,最终参与RNA中甲基基团去除的酶被称为去甲基酶或m6A修改器[4]。

1.1m6A甲基转移酶 m6A甲基转移酶是参与甲基转移酶复合物形成的蛋白质,包括甲基转移酶样蛋白 (methyltransferase like,METTL)3和 METTL14及其辅因子WT1相关蛋白 (WT1 associated protein,WTAP)、RNA结合基序蛋白(RNA binding motif protein,RBM)15/15b、病毒样m6A甲基转移酶相关蛋白 (virlike m6A methyltransferase associated protein,VIRMA)、锌指CCCH域含蛋白1等[5]。

已经在mRNA上鉴定出的最典型的甲基转移酶是甲基转移酶复合体,也称为m6A书写复合体,它的异源二聚体核心由METTL3 和METTL14 构成。METTL3是一个催化亚基,METTL14是一个促进RNA连接的复杂亚基[6]。甲基转移酶复合体中第三个重要的甲基转移酶是与METTL3-METTL14相互作用的WTAP[7]。在m6A书写复合体中,METTL3是具有催化m6A甲基转移酶的酶活性的亚基,它作为一个RNA甲基化的全局调节器,在METTL14的帮助下与目标RNA结合,其作用的特异性取决于mRNA不同区域的原动力,且与细胞状态转换相关联,当细胞失去稳态时,METTL3触发细胞内mRNA的整体甲基化,通过调节mRNA的不同亚群来决定细胞的功能和命运[8]。

值得注意的是,除了上述以复合物形式发挥作用的甲基转移酶外,METTL3的一个同源物：METTL16已被鉴定为一种新的独立的RNA甲基转移酶,它调节细胞SAM水平和U6小核RNA甲基化;最近发现,METTL16还对DRACH基序外环或二级结构中的腺苷基具有特异性的催化作用[9]。此外,还有一个m6A书写器,VIRMA,也被称为KIAA1429,是m6A在3'UTR和停止密码子周围沉积所必需的[10]。

1.2m6A去甲基化酶 m6A去甲基化酶是一种脱甲基酶蛋白,可以动态地去除m6A标记。肥胖基因相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)是第一个被证实能催化m6A去甲基化的蛋白质[11]。第二个被发现的m6A去甲基化酶是AlkB同源蛋白5 (AlkB homolog 5,ALKBH5),是FTO的同源物,与其一同维持转录组中m6A水平的平衡[12]。虽然FTO和ALKBH5都属于依赖于α-酮戊二酸的双加氧酶家族,但这两种去甲基化酶在组织中的表达谱差异、不同的细胞内亚定位,以及两者不同的晶体结构,共同导致了两种蛋白的底物特异性[13]。

已知ALKBH5只作用于m6A,而FTO也可以将N6,2′-O-二甲基腺苷 (N6,2′-O-dimethyladenosine,m6Am) 和 N1-甲基腺嘌呤修饰的RNA脱甲基[14]。有趣的是,既往报道称FTO比m6A更倾向于催化m6Am[15],而最新的生物化学研究发现,FTO的去甲基化活性对于相同 RNA 序列中的内部m6A和m6Am是相同的[16]。这些研究发现,FTO在细胞核和细胞质中表现出不同的底物偏好,在不同类型的细胞中具有不同的定位模式。值得注意的是,最新的研究发现了一种新的m6A去甲基化酶RBM33,通过与ALKBH5形成复合物,在ALKBH5介导的mRNA m6A去甲基化中起关键作用[17]。

1.3m6A甲基化阅读蛋白 m6A的功能被 “m6A阅读器”识别,即甲基化阅读蛋白,也被称作m6A结合蛋白。目前m6A结合蛋白包括同源域(YT521-B homology,YTH)结构域蛋白家族,即YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2;核异质核糖核蛋白家族(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,HNRNP),包括HNRNP A2/B1和HNRNPC等;以及胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白 (Insulin Like Growth Factor 2 mRNA Binding Protein 3,IGF2BPs)[18]。

YTH蛋白家族中进化保守的YTH结构域可以选择性识别m6A。YTHDC2可能在调控mRNA稳定性方面发挥作用[19],且其对m6A的选择性识别在胚胎分化过程起到重要作用[20]。YTHDF1和YTHDF3在细胞质中协同工作,以增强目标mRNA的翻译,而YTHDF2已被证明通过使m6A修饰的RNA在mRNA衰变机制中局部化,从而影响其稳定性。YTHDC2可以促进其靶点的翻译效率,同时通过与不同的结合蛋白相互作用降低RNA的稳定性。而YTHDC1作为唯一的核m6A阅读蛋白,调控其靶蛋白的核加工过程,包括选择性剪接、m6A修饰mRNA的输出和染色质相关RNA的转换[21]。

相比之下,HNRNPC和HNRNPG不能直接结合m6A位点,但它们可以通过识别和结合依赖于m6A的结构靶点来介导包含m6A修饰的转录本的选择性剪接过程[22]。真核起始因子3通过结合mRNA的5 '-UTR中的m6A位点启动翻译过程,而IGF2BPs(包括IGF2BP1/2/3) 使靶基因和相应的翻译更加稳定[23]。此外,富含脯氨酸的卷曲螺旋2a是一种新型的m6A结合蛋白,它通过与编码序列中的一致GGACU模体结合,以依赖于m6A的方式稳定mRNA的表达[24]。

2 m6A甲基化修饰与缺血性心肌病

2.1m6A甲基化修饰与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS) AS是心肌梗死、中风和冠心病等CVD的潜在原因[25]。AS是指由脂质和纤维成分组成的斑块在血管壁上不断积聚,最终形成AS坏死病变[26]。AS是冠心病的发展阶段之一,随着心肌长期缺血导致心肌收缩力下降,最终发展为心力衰竭[27]。血管内皮细胞与血管再生、血管舒张、血管炎症等血管生理学密切相关。血管内皮细胞的增殖和侵袭影响AS斑块的稳定性、血小板活化和AS并发症的发生。

内皮细胞在功能和结构上的完整性对于维持血管稳态是必不可少的,血管内皮细胞的功能障碍被认为是AS起始和进展的一个因素[28]。氧化低密度脂蛋白 (oxidized low density lipoprotein,ox-LDL) 通过诱导内皮细胞的激活和功能障碍等多种机制调控AS的发展,是AS的主要危险因素[29]。Dong等[30]建立由ox-LDL处理的人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells,HUVECS) 模型,发现METTL3在ox-LDL诱导的失调的HUVECS中高度表达,且利用生物信息学分析筛选出了JAK-STAT信号通路的相关基因。此前,JAK2/STAT3信号通路已被发现参与AS的发病机制[31],在敲除METTL3的HUVECS中,JAK2 mRNA和蛋白水平以及p-STAT3蛋白水平显著降低。METTL3基因的下调抑制了HUVECS中的JAK2/STAT3信号通路,表明METTL3敲除通过降低JAK2的表达和mRNA的稳定性,以m6A依赖的方式抑制JAK2/STAT3信号通路。由此可见,METTL3/JAK2/STAT3轴在AS过程中的重要作用以及依赖IGF2BP1的调控机制,深入了解m6A相关基因调控网络可能有助于更好地管理包括AS在内的m6A相关疾病。

既往研究表明,AS病变形成的主要刺激因素是内皮细胞的局部激活和通透性的增加,这可能是由血管分叉和弯曲部位的血流动力学改变触发的[32]。Chien等[8]利用体外和体内实验方法,证实了紊乱流动和振荡剪切应力 (oscillatory stress,OS) 引起的METTL3表达和m6A高甲基化的增加。METTL3高甲基化m6A的多个下游靶点,上调Nod样受体蛋白(Nod-like receptor pyrin domain,NLRP)1,下调Krüppel样因子(Krüppel-like factor,KLF)4,引发AS反应。在OS下敲除METTL3后,NLRP1 mRNA表达下调,KLF4 mRNA表达上调。在暴露于OS的HUVECS中敲除METTL3后,单核细胞的黏附能力明显降低,而同时过表达NLRP1和(或)敲除KLF4可增加单核细胞黏附,因此表明这两个因素在调节单核细胞黏附中的关键作用,以及单核细胞与内皮细胞的黏附是AS发生的关键病理事件。同时,致AS动脉结扎术在诱导斑块的形成和动脉管腔大小的减少的同时介导了METTL3和NLRP1的上调。shMETTL3可消除AS动脉结扎术诱导的血小板形成,并降低METTL3和NLRP1的表达。以上结果表明m6A甲基转移酶METTL3是一个关键的调节因子,介导OS诱导的RNA转录本上的m6A修饰来调节AS。抑制METTL3可以抑制OS诱导的m6A甲基化,炎症反应和单核细胞黏附,逆转OS条件下内皮细胞 NLRP1和KLF4表达水平的变化。为RNA表观遗传学参与剪切应激的细胞反应和AS的发病机制提供了实验证据。METTL3作为OS诱导的内皮细胞促炎反应的关键调节因子的发现,提示了一种通过靶向于METTL3治疗AS的潜在方法。

2.2m6A甲基化修饰与心肌缺血再灌注 心肌缺血再灌注损伤是临床最常见的缺血性心脏病病理状态之一,尤其是急性心肌梗死 (acute myocardial infarction,AMI) 后经皮冠状动脉介入治疗。心肌心肌缺血再灌注损伤是AMI治疗失败和病情恶化的主要原因之一[33]。

心脏疾病如心肌缺血和心力衰竭通常伴有不可逆的心肌细胞 (cardiomyocyte,CM) 损失。心脏疾病相关的持续的CM损失和心功能不全在很大程度上归因于其有限的再生能力[34]。因此,促进心脏缺血再灌注损伤后成人CM增殖再激活的策略尤为重要。Ke等[35]研究了m6A修饰在出生后和成人损伤期间心脏再生中的作用,发现了m6A去甲基化酶ALKBH5在CM的增殖和再生中起重要作用。敲除小鼠的ALKBH5显著抑制了CM的增殖和再生,而AAV9介导的ALKBH5过表达促进了AMI损伤后心脏功能恢复。在机制上,ALKBH5介导的m6A去甲基化改善了YTHDF1 mRNA的稳定性,增加了其表达的同时促进了Yes相关蛋白(yes-associated protein,YAP)的翻译。YAP通过Hippo信号通路参与调节器官大小,细胞增殖和干细胞命运的决定。在人诱导的多能干细胞来源的CM中,ALKBH5和YTHDF1表达的调节一直产生类似的结果。这一研究强调ALKBH5-m6A-YTHDF1-YAP轴在调节CM重新进入细胞周期中的重要作用。

既往研究发现,缺血后再灌注过程中发生凋亡和内质网应激等变化[36]。内质网应激可以转录激活一系列由应激反应转录因子家族紧密控制的适应通路,包括激活转录因子4 (activating transcription factor 4,ATF4),它控制内质网应激相关基因的表达[37]。Wang等[38]探讨了m6A甲基转移酶WTAP在缺血再灌注损伤中的作用及其对m6A修饰ATF4 mRNA、内质网应激和凋亡的影响,在AC16细胞中沉默WTAP后进行缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)发现,沉默WTAP显著抑制H/ R引起的m6A水平升高,且显著抑制H/ R诱导的细胞凋亡。进一步研究显示,沉默WTAP对凋亡标记蛋白和内质网应激标记蛋白表达的上调都有抑制作用,表明H/R通过上调WTAP使AC16细胞m6A水平升高,促进细胞凋亡和内质网应激。在注射WTAP shRNA载体的心肌梗死大鼠模型中,缺血/再灌注(ischemia and reperfusion,I/R)处理显著降低了大鼠的射血功能、缩短部分和收缩压,而WTAP的下调逆转了这一趋势。沉默WTAP显著改善I/R诱导的CM凋亡,且可以降低I/R诱导的m6A水平,也可以降低I/R诱导的CM中ATF4的上调。这些结果表明,ATF4可以结合WTAP的启动子区域调控其转录,且下调WTAP通过减弱ATF4的mRNA稳定性,进而降低ATF4的表达,最终对CM凋亡和内质网应激产生保护作用。通过靶向WTAP/ATF4消除内质网应激,明确了心肌梗死的一个新的分子机制,为I/ R诱导的损伤提供了一种新的潜在的治疗途径。

3 m6A甲基化修饰与心脏重构

3.1m6A甲基化修饰与心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF) MF是CVD的常见病理结果,也是心力衰竭的重要危险因素[39]。纤维化组织由于缺乏传导电信号和引起机械收缩的能力而导致心脏功能的严重损害。因此,抗纤维化治疗已经成为一种改善致MF心脏疾病预后的有效手段。Li等[40]利用生物信息学工具分析circCELF1序列发现,circCELF1具有miR-636的结合位点,而miR-636的一个重要靶基因是Wnt信号通路抑制因子2 (Dickkopf2,DKK2)。DKK2是Wnt/β-cateninn信号通路的拮抗剂,可抑制多种纤维化过程。因此,circCELF1可能通过miR-636/DKK2通路在MF中发挥调控作用。血管紧张素(angiotensin,Ang )Ⅱ和相关介质的信号系统,在促纤维化过程中起核心作用[41]。本研究中,AngII诱导的成纤维细胞激活与circCELF1表达下调有关。Ang II导致miR-636表达增加,提示circCELF1/miR-636是MF的重要途径。过表达circ-CELF1或miR-636抑制剂可显著逆转Ang II对DKK2的抑制作用,提示Ang II通过circCELF1/miR-636通路抑制DKK2的表达。进一步研究发现,circCELF1通过影响FTO的表达降低了DKK2的m6A水平。综上所述,circCELF1通过上调FTO的表达降低了DKK2的m6A水平,从而抑制了miR-636与DKK2的结合,最终促进了DKK2的表达。FTO通过对circCELF1-miR-636-DKK2轴进行m6A甲基化修饰,从而抑制MF的进展。

3.2m6A甲基化修饰与心肌肥厚 Gao等[42]发现,甲基化酶METTL3和CM的肥大以及心脏重构相关。他们检测到主动脉缩窄模型鼠左心室的心肌肥厚相关pi-RNA (Cardiac-hypertrophy-associated piRNA,CHAPIR) 水平升高,进而研究发现,CHAPIR-PIWIL4复合物直接与METTL3相互作用并阻断Parp10 mRNA转录物的m6A甲基化,上调多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶10的表达,进而抑制糖原合成酶激酶-3β活性,从而导致核钙调神经磷酸酶依赖性活化T细胞核因子4积累和病理性肥大的进展。这种机制呈现出了一个心肌肥厚和适应性不良心脏重构的新型靶向治疗。

4 m6A甲基化修饰与糖尿病相关CVD

4.1m6A甲基化修饰与糖尿病后CM焦亡 焦亡是一种以caspase-1激活,焦孔素D 成熟,焦亡泡形成为特征,并伴随胞内促炎介质(IL-1β、IL-18)大量释放的细胞程序性死亡[43],在糖尿病和冠心病的发生和发展过程中均具有重要意义[44]。参与焦亡的主要信号通路是caspase-1激活,导致IL-1β、IL-18和焦孔素D的成熟过程。Meng等[45]探究了METTL14介导的m6A修饰在焦亡和糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)进展中的作用。建立DCM大鼠模型,通过得失功能实验确定METTL14-TINCR-NLRP3轴在焦亡和DCM中的作用。RNA下拉和RNA免疫共沉淀检测被用来验证潜在的相互作用。结果表明焦亡密切参与了DCM的进展。在DCM大鼠CM中,METTL14表达下调。在功能上,METTL14通过下调lncRNA TINCR抑制焦亡和DCM,进一步降低了焦亡相关关键蛋白NLRP3的表达。在机制上,METTL14增加了TINCR基因的m6A甲基化水平,导致其下调。并且,m6A解读器蛋白YTHDF2对m6A甲基化至关重要,并介导了TINCR的降解,TINCR通过提高NLRP3 mRNA的稳定性,对其进行正向调控。此研究揭示了METTL14介导的m6A甲基化和lncRNA调控在焦亡和DCM中的新作用。

4.2DCM与FTO调控 Ju等[46]发现,DCM中总m6A水平较高,而脂肪量和FTO水平下调。FTO在DCM模型小鼠中过表达可通过减少MF和CM肥大改善心功能。该项研究以(db/ +)小鼠为对照,建立了db/db小鼠 DCM模型,并对比了两组心脏组织样本的m6A甲基化谱,发现db/db小鼠中的m6A RNA甲基化发生了改变。生信分析表明,差异甲基化基因与MF、心肌肥厚和心肌能量代谢特别相关。与db/+小鼠相比,db/db小鼠FTO表达下调,且db/db小鼠FTO过表达改善心功能,显著减少MF和肌细胞肥大。这一研究提供了FTO介导的DCM的治疗新思路。

5 小结与展望

靶向m6A调节因子是治疗常见CVD的一种新的治疗策略。通过改变m6A的调节因子来控制m6A的水平,可能是防止心脏功能恶化的一种新的有效治疗方案。总的来说,m6A修饰在心脏发育、再生和疾病中起着至关重要的作用,而m6A及其调节器可能是治疗心力衰竭的潜在靶点。然而,m6A与其他CVD甚至与心血管相关疾病之间的可能联系仍未被完全探索。虽然在不同的动物或细胞模型中已经确立了RNA修饰酶在m6A修饰中的心脏保护作用,但缺乏足够的临床证据支持。因此,需要更多的临床研究来进一步验证m6A甲基化修饰在CVD中的作用以及其在诊断和治疗中的应用前景。

此外,为了更好地理解m6A影响RNA命运的机制,我们必须开发新的和更好的工具或方法来更精确地操纵特定位点的特定转录本的m6A甲基化,以精准靶向m6A甲基转移酶、去甲基酶、或甲基化阅读蛋白的方式,安全有效地将m6A甲基化应用于CVD的治疗。