隋红霞王培旭

(1天津市河西区东海街社区卫生服务中心,天津 300222;2烟台山医院药剂科,烟台 264000)

氨基酸是含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称,氨基酸的分析技术对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义[1-2]。一方面谷氨酸钠注射液是一种用于治疗代谢性酸中毒、电解质紊乱、肝性脑病的药物,内含谷氨酸钠,因其无发色基团且极性较大为高灵敏度和高选择的分析带巨大来挑战[3-4]。另一方面,谷氨酸钠含量的准确测定对于药品的质量控制和使用效果的评价以及不良反应的控制具有重要的意义[5],因此,谷氨酸钠注射液中谷氨酸钠含量的准确测定是药品质量控制和用药效果评价的关键步骤。

由于谷氨酸无发色基团且极性较大,难以在C18色谱柱保留,无法直接测定,需要采用衍生化反应将其转化成易电离物质进行间接测定[2]。高效液相色谱是分析化学中发展最快,应用最广的领域之一,具有操作方便、准确度高、特异性强等特性[6],使其成为临床化学、生物学和毒物学等领域中有效分离和质量监控手段[7-8]。质谱检测具有选择性好,检测限低,较高的灵敏度,线性范围宽,结构简单,成本低廉,无放射,无污染等优点[9-10]。本研究采用柱前衍生化技术结合高效液相色谱串联高分辨质谱检测法测定谷氨酸钠注射液中谷氨酸钠的含量,为准确测定谷氨酸钠注射液中谷氨酸钠的含量提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1仪器 超高效液相串联高分辨质谱仪Triple TOF 5600+(AB Sciex公司,美国),Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm)色谱柱(Waters公司,美国),YY91001-1999型全玻璃注射器(金坛市第二注射器厂制造),H00005型超声洗涤机(无锡超声电子设备厂),抽滤设备(HENGAO T&D公司,中国),混合纤维素酯微孔滤膜(北京化工学校附属工厂),2D-2型自动电位滴定计(上海第二分析仪器厂),BT125D型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.1.2试剂 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,C5H9NO4,色谱纯,国药集团化学试剂有限公司,批号:B2216322),6-氨基己酸(6-Aminocaproic acid,IS,C6H13NO2,色谱纯,国药集团化学试剂有限公司批号:RH431250),谷氨酸钠注射液(上海旭东海普药业有限公司),3-溴丙基三苯基磷(3-BMP,C21H21BrP,色谱纯,国药集团化学试剂有限公司批号:K2108775),三乙胺(色谱纯,天津市大茂化学试剂厂批号:20211126),实验用水均为重蒸水。

1.2 方法

1.2.1溶液的配置 1)对照品溶液的配置。参照以下方法配制0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的对照品溶液:称取0.0200g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成2mg/mL的溶液;称取0.0100g谷氨酸对照品,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成1mg/mL的溶液;取此溶液1mL放入10mL的容量瓶中,用重蒸水定容,配制成0.1mg/mL的标准溶液;取0.0050g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成0.5mg/mL的溶液;称取0.0150g谷氨酸,放入10mL容量瓶中,用重蒸水溶解定容,配制成1.5mg/mL的溶液。

2)供试品溶液的配置。精密量取待测谷氨酸钠注射液1.0mL用重蒸水溶解定容至1000mL,溶解,待测。

1.2.2样品衍生化反应 现有的氨基酸一般常使用3-BMP作为衍生化试剂,用5%三乙胺提供氨基酸与3-BMP衍生物提供反应所需的碱性条件。

精密称取0.0040g 3-BMP,加入1mL乙腈和水溶液,超声溶解,即得衍生化试剂。将其放入冰箱中冷藏,避光保存。

取300μL谷氨酸和50μL内标工作液于聚乙烯管内,加50μL衍生化试剂,60℃下反应30min即可完成衍生化,用于后续测定。

1.2.3色谱条件 色谱和质谱条件:色谱柱为反相色谱柱Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm),流动相的组成为0.1%甲酸水和甲醇溶液,进样量为1μL,流速为0.40μL/min,使用非数据依赖模式扫描谷氨酸衍生化物母离子和特征碎片分别为 450.18→320.16。

1.2.4流动相和检测条件的选择 分别量取0.1%甲酸溶于水和甲醇溶液中作为流动相A和B,在0～5～20min内使用10%～19%～19%的流动相B的梯度测定谷氨酸标准溶液,观察测定的灵敏度和峰形。

1.2.5标准曲线的建立 由配制的一系列对照品溶液(0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL),依次与3-BMP进行衍生化反应后,分别取一定量,按照1.2.3方法进样分析,测定峰面积,以谷氨酸的峰面积对其浓度作图,计算回归方程(Y=bx+a),即为谷氨酸的标准曲线。

1.2.6重复性试验 取1.2.1中配置好的1mg/mL的对照品溶液,与3-BMP进行衍生化反应后,重复进样9次,按照1.2.3方法进样分析,测定峰面积,计算9次进样的相对标准偏差。

1.2.7回收率试验 为了使未加标的样品与加标的样品稀释相同的倍数,在样品中加入同体积的流动相,即将300μL供试品溶液和300μL的1mg/mL谷氨酸对照品溶液混合,经衍生化后,取20μL混合液进样。同理将300μL供试品溶液和300μL的流动相混合,经衍生化后,取20μL混合液进样。再将300μL的1mg/mL谷氨酸对照品溶液与300μL流动相混合,经衍生化后,取20μL混合液进样。重复5次,得到回收率数据,对5个回收率进行相对标准差的计算。

1.2.8最低检测限和最低定量限测定 在本实验条件下,由1mg/mL谷氨酸对照品溶液逐级稀释,采用1.2.3方法进样分析,测定进样浓度下的信噪比(S/N),当S/N=3时的对照品溶液中谷氨酸的浓度即为最低检测量,当S/N=10时的对照品溶液中谷氨酸的浓度即为最低定量限。

2 结果与讨论

2.1 衍生化条件的优化

使用3-BMP标记Glu的具体过程如图1所示。图2表明谷氨酸衍生物的母离子和靶向标记氨基官能团的特征碎片450.18→320.16。而后通过非数据依赖型扫描模式检测谷氨酸,结果如图3所示,谷氨酸在12.85min溶出。而后通过考察谷氨酸衍生物峰面积,图4表明随着反应时间的延长逐渐增大并在100min时趋于平稳,200min时保持不变,因此,当在60℃下衍生100min时,标记效率最高。

图1 谷氨酸与3-BMP的衍生化反应及化学结构

图2 谷氨酸衍生物的特征碎片

2.2 标准曲线的建立

分别配制0.024～1000pmol的对照品溶液,依次进样记录峰面积。以谷氨酸峰面积为纵坐标,对应浓度为横坐标,绘制标准曲线,如图3所示,以谷氨酸的浓度对其峰面积进行线性回归,得回归方程为:y=0.0007x+0.003,相关系数R2=0.9999,即在0.024～1000pmol范围内呈现良好的线性关系。

图3 谷氨酸衍生物的UHPLC-HRMS色谱图

图4 60℃下3-BMP标记谷氨酸反应时间进程

表1 谷氨酸衍生物工作曲线和检测限

2.3 重复性

取低中高3个浓度的谷氨酸对照品溶液,重复进样9次,分析操作重复性(结果如表3所示)。在进样量相同时,各个峰面积大小接近,日内日间RSD为2.19%～3.04%和1.05%～3.97%,表明该方法的重复性良好,可满足对供试品的测定需求。

表2 通过日内和日间分析确定建议方法的准确度和精密度

2.4 回收率实验

按照1.2.7方法检测方法的准确性,结果见表3,下表中样品中谷氨酸的回收率为86.15%～97.55%,平均回收率为91.71%,RSD为1.67%～2.64%,表明该方法可准确测定谷氨酸的含量,可用于谷氨酸钠注射液中的样品浓度测定。

表3 谷氨酸测定的回收率实验

2.5 最低检测限

在本实验条件下,由1mmol/L谷氨酸对照品溶液逐级稀释至4fmol时,信噪比为3,即方法的最低检测量为4.00fmol;当谷氨酸对照品溶液浓度为24.25fmol时,信噪比为10,即该方法的最低定量限为24.25fmol。说明该方法的灵敏度高,可满足检测需求。

3 结论

选用色谱柱为Kinetex C18(2.0×100mm,1.7μm),流动相为0.1%甲酸水和甲醇溶液,样本中谷氨酸以3-溴丙基三苯基磷(3-BMP)进行衍生化反应,流速为0.40μL/min,谷氨酸衍生化物母离子和特征碎片分别为450.18→320.16等实验条件,能较好地检测出样品中谷氨酸的含量。

该方法线性范围宽,灵敏度高,准确度好,可应用到临床研究中,检测患者血浆中氨基酸的含量,作为阻塞性心血管疾病危险的早期诊断辅助指标,为患者临床用药方案的制定提供参考,也可用于谷氨酸钠注射液中谷氨酸的含量检验工作中,为药品有效成分含量检验具有非常重要的作用。

利益冲突:所有作者均申明不存在利益冲突。