龚敏 陈明亮 金鹏 纪少凡 王朝政 李备

（1. 海南省现代农业检验检测预警防控中心 海南海口 570100；2. 海南医学院第一附属医院康复医学科 海南海口 570100；3. 浙江农林大学农业与食品科学学院 浙江杭州 311300；4. 海口海关技术中心/海南省食品检验检测中心 海南海口 570311）

黄曲霉毒素主要是黄曲霉和寄生曲霉等菌种产生的次生代谢产物，是一类聚酮衍生的呋喃氧杂萘邻酮物，产生并分布于农作物生长、收获、储存、运输等各个阶段，常见的黄曲霉毒素有B1、B2、G1、G2四种亚型，是目前具有最高生物学活性的毒素，毒性是氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍[1]。研究表明，黄曲霉毒素在水产饲料中普遍存在[2-3]，并在水产生物体内富集，造成水产生物饲料转化率和抗病能力低、死亡率增加[4-6]。同时，水产生物在摄入被黄曲霉毒素污染的饲料后，其肌肉组织中存在毒素残留风险[7]，影响消费者的身体健康。2019 年11 月，水产品中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的检测被列入海关总署《2019 年度进出口食品化妆品抽样检验及风险计划》补充计划，但目前尚无水产品中黄曲霉毒素残留含量的检测标准。传统的黄曲霉毒素检测方法主要有酶联免疫法和免疫亲和层析净化-液相色谱法，且现有的水产品中黄曲霉毒素检测的文献较少，前处理方法主要采用固相萃取净化[8-9]，存在检测过程繁琐、耗时、成本高等问题，对其质谱裂解规律的研究亦鲜有报道。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe），是近年来国际上最新发展起来的一种用于检测的快速样品前处理技术，利用吸附剂与基质中的杂质相互作用而达到除杂净化的目的，具有快速、简便、成本低、对环境友好等优势[10]。本研究采用QuEChERS[11-12]结合超高效液相色谱-串联质谱仪检测，建立了一种水产品中4 种黄曲霉毒素残留量的高效检测方法，并对其可能的质谱裂解机理进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 三重四级杆液质联用仪（美国Waters 公司）；旋涡混匀器（广州IKA 公司）；离心机（Eppendorf 公司）；G-285 电子天平（Mettler公司）。

1.1.2 试剂 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均为色谱纯（德国默克公司）；中性氧化铝、C18、PSA、佛罗里硅土吸附剂（迪马科技）；QuEChERSEMR-Lipid（安捷伦公司）；黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2 标准品（纯度均大于等于99%，购自天津阿尔塔）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液配制 标准品采用甲醇作为溶剂，配制成25 μg/mL 标准储备液，置于-20℃下避光保存。

1.2.2 样品处理 将粉碎匀浆后的样品准确称取5 g（精确至0.01 g），于50 mL 离心管中，加入20 mL 乙腈涡旋震荡提取5 min 后，加入5 g 无水硫酸钠，涡旋震荡混合1 min；以9 000 r/min 离心5 min，吸取1 mL 至玻璃试管中，加入100 mg 中性氧化铝吸附剂，涡旋混合1 min 后，以5 000 r/min离心3 min，取上清液过滤膜（0.22 μm），待LCMS/MS 测定。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）；流速：0.35 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流动相：5 mmol 乙酸铵-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱程序见表1。

1.2.4 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），正离子扫描，多反应监测（MRM）模式，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度 500 ℃，脱溶剂气流速1 000 L/h，锥孔反吹气流速150 L/h，碰撞气体（氩气）流量0.14 mL/min。质谱优化条件见表2。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

水产品含有大量的蛋白质、脂肪。乙腈极性较大，作为提取溶剂时，蛋白质、脂肪等难被提取出来，能够有效减少提取过程中的共萃物，被作为QuEChERS 法常用的提取溶剂。黄曲霉毒素类化合物属于弱极性化合物，4 种黄曲霉毒素均易溶于乙腈。分别考察乙腈、0.1%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、1%乙酸-乙腈作为提取溶剂的提取效果。结果表明，酸化乙腈的提取效果与直接采用乙腈作为提取溶剂的提取效果无显著差异，故采用乙腈作为水产品中4 种黄曲霉毒素的提取溶剂。

2.2 净化条件的选择

动物源性样品基质复杂，脂质干扰是影响检测的重要因素，不仅会导致仪器对待测组分的灵敏度下降，还会缩短仪器和色谱柱的使用寿命，所以质谱分析前应进行除脂净化。本研究使用EMR-Lipid、C18、PSA、中性氧化铝、佛罗里硅土对脂肪有一定吸附能力的吸附剂进行净化。结果表明，使用EMR-Lipid、C18 和佛罗里硅土作为吸附剂回收率偏低，尤其在使用佛罗里硅土净化时，回收率不足50%；PSA 作为吸附剂虽然回收效果好，但在检测黄曲霉毒素G2时不能有效除去谱图中的杂质峰，基线不平稳，影响定量分析的准确性。采用中性氧化铝作为净化剂时，4 种黄曲霉毒素的回收率好，基线平稳，能够满足检测需求，主要是由于中性氧化铝作为吸附剂，分子表面可呈电中性，易吸附芳香族和脂肪胺等富电化合物，同时能够保留含氧、硫、磷的基团。经中性氧化铝净化样品和未净化样品检测的黄曲霉毒素G2谱图见图1。不同净化方式下，4 种黄曲霉毒素在罗非鱼和对虾中的添加浓度水平为10.0 μg/kg 时，回收率见图2。

图1 净化前后罗非鱼样品中黄曲霉毒素G2 色谱图

图2 不同净化方式在添加水平为10.0 μg/kg 时的回收率

2.3 色谱条件选择

分别考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L 乙酸铵水溶液-乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相对峰形、响应值等影响。结果表明：选择0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵水溶液-乙腈作为流动相时，4 种黄曲霉毒素响应值最高、峰形最好。所以选用 0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵水溶液乙腈作为流动相体系，4种黄曲霉毒素标准色谱图见图3。UPLC 使用的超高压色谱柱体积小，进样量过大容易产生溶剂效应，导致峰形变宽，出现前延峰；同时，进样量大小直接影响到仪器灵敏度和方法检测限。本研究以5 ng/mL 的黄曲霉毒素B1标准溶液为例，比较了进样量在2 、5、6、7、8、9、10 μL 时的峰形和响应值变化。由图4 可见，进样量大于5 μL时，峰形开始变宽，峰高不再随进样量增大成比例增高，5 μL 为最佳进样量。

图4 不同进样体积黄曲霉毒素B1 色谱图

2.4 黄曲霉毒素的裂解机理研究

采用质谱针泵直接注射黄曲霉毒素标准品，一级质谱采用正离子扫描待测物的母离子，选用[M + H]+作为分子离子峰。经氦气轰击分子离子后，利用二级质谱对碎片离子进行分析，选用丰度最高的2 个离子碎片作为子离子。通过质谱对4 种黄曲霉毒素八组离子对可能的裂解过程进行详细分析。黄曲霉毒素的裂解机理见表3。

表3 黄曲霉毒素的裂解机理

表4 四种黄曲霉毒素的线性方程及相关系数

2.5 基质效应、线性关系及检出限

采用相对响应值法（基质中待测组分响应/纯溶剂中待组分响应×100%）[13-14]对基质效应进行评价。结果表明：经过中性氧化铝净化后，4 种黄曲霉毒素在水产品中的基质添加回收率均在90%～100%，基质效应可忽略不计。4 种黄曲霉毒素在0.1～10.0 ng/mL 有良好的线性关系，线性方程及相关系数见表 4。以实际检测时的信噪比（S/N）10 作为定量限，本方法的定量限为0.4 μg/kg。

2.6 回收率与精密度试验

采用罗非鱼和对虾样品作为基质，分别进行低、中、高3 个水平的加标回收实验，每个添加浓度做6 次平行试验，考察回收率和精密度。回收率及RSD见表5、6。回收率在83.1%～95.4%，RSD为2.0%～6.2%。

表5 罗非鱼中4 种黄曲霉毒素不同添加浓度水平下的平均回收率和相对标准偏差（n=6）

表6 对虾中4 种黄曲霉毒素的平均回收率和相对标准偏差（n=6）

3 结论

利用QuEChERS 结合UPLC—MS/MS，建立了水产品中4 种黄曲霉毒素的超高效液相色谱-质谱/质谱检测方法。该检测方法采用乙腈作为提取溶剂，中性氧化铝为吸附净化剂，以多反应监测模式扫描，外标法定量。通过分析结果可知，该检测方法操作简便、灵敏度高、定量准确，能满足水产品中黄曲霉毒素的检测要求。