王海娟 薛利宁 余韶华 季小诗 闵 微 王秀利 林长青

北京热景生物技术股份有限公司参考溯源实验室，北京 102600

睾酮是调节性分化、促进第一和次性特征的关键男性激素。低睾酮水平与胰岛素抵抗有关，会提高患糖尿病和代谢综合征的风险[1-2]。睾酮缺乏也与慢性疾病有关，如心血管疾病和骨质疏松症[3]。免疫测定法常用于测定人血清中睾酮的水平。大多数免疫分析方法的准确性不够，尤其是针对女性睾酮浓度低和男性雄激素缺乏症的情况[4]。因此，建立血清睾酮检测的参考方法是实现其结果准确可比的前提。同位素稀释液相色谱串联质谱（isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID LC-MS/MS）法已被广泛应用于建立有机生物标志物具有计量溯源性的参考测量程序。它通过选择性反应监测具有准确识别和测量分析物、灵敏度高、特异性高的特点，被认为是一种基准法，具有最高的计量质量，描述详细且易于理解的操作方法，以及完整的不确定度说明[5-6]。经调研，目前国际医学检验溯源联合委员会（Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）列表里的睾酮参考方法主要有两类，一类是利用气相色谱串联质谱的参考方法，如比利时根特大学[7]、德国临床化学和检验医学学会[8]的方法；另一类为利用液相色谱串联质谱的参考方法，如新加坡卫生科学局（Health Sciences Authority，HSA）[9]、美国疾病预防控制中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）[10]、美国国家标准和技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）[11]的方法。其中气相色谱串联质谱参考方法涉及睾酮的衍生化，美国CDC及NIST的参考方法也需要固相萃取或多步液液萃取，操作繁琐，耗时较长。新加坡HSA的方法前处理相对简单，不涉及衍生化，使用一步法液液萃取。但北京热景生物技术股份有限公司参考溯源实验室（本实验室）运行该方法后发现色谱流动相梯度为等度洗脱，样本分离效果不好，精密度较差。本实验室在HSA的参考方法基础上进一步改良，希望建立一个操作简便，准确度、精密度均良好的参考方法。参考美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相关文件对该方法的精密度、正确度、定量限等指标进行评价，评价合格后对司内睾酮临床常规检测试剂（CLIA法）进行重新溯源。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

睾酮标准品（纯度99.84%）购自日本国家计量研究所（Tsukuba，Japan）；睾酮同位素内标（睾酮-2，3，4-13C3，纯度99%）购自美国剑桥同位素实验室；甲醇、甲酸、叔丁基甲基醚、乙腈（色谱纯）均购自德国Sigma公司。

1.2 主要设备

液相色谱串联质谱仪由Triple Quad™3500串联质谱仪、ExionLCTM AC液相色谱仪、Analyst 1.5.2数据处理软件组成（美国SCIEX公司）；电子天平、pH计（美国梅特勒托利多），移液器（德国Eppendorf），C2000化学发光免疫分析仪、临床常规血清睾酮检测试剂盒（CLIA法）（北京热景生物技术股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 ID LC-MS/MS分析 色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，（2.1 mm×150 mm，3.5 μm，美国Agilent公司）；流动相为水（含0.1%甲酸）-乙腈，梯度洗脱，进样体积为10 μl，流速为0.3 ml/min。使用电喷雾电离源（ESI）正离子模式。雾化温度为500℃，喷雾电压为5500 V，气帘气为30 psi，喷雾气为65 psi，碰撞气为7 psi，辅助加热气为65 psi。多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式分析，睾酮及其内标分别以289.3→97.1和292.2→100.0为定量离子对，289.3→109.0和292.2→112.0为定性离子对。

1.3.2 样本前处理 移取0.45 ml血清于天平上准确称量，并通过重量法准确添加睾酮-2，3，4-13C3内标品工作液，睾酮与内标的质量比要尽量接近1∶1，涡旋混匀后室温静置平衡2 h，之后用碳酸钠溶液（0.1 g/ml）调整pH值至9.8左右。加入甲基叔丁基醚（8 ml）进行液-液萃取，涡旋混匀，4200 rpm离心5 min，上清液转移至玻璃试管中（可重复萃取），在40℃下氮气吹干，残渣用50%甲醇复溶，0.22 μm注射器过滤膜过滤后用于LC-MS/MS分析。

1.3.3 标准品、内标储备液及工作液配制 采用称重法，标准品首先用无水乙醇配成浓度为1500 μg/g的储备液，然后用50%甲醇稀释成浓度为13.00 μg/g的中间液，中间液用10%甲醇稀释成约0.25 μg/g的标品工作液，-20℃保存；同理同位素用无水乙醇配成浓度为3 μg/g的储备液，然后用50%甲醇稀释成约0.05 μg/g的内标工作液1，用于测量高浓度睾酮的样品，另用10%甲醇稀释成约0.01 μg/g的内标品工作液2，用于测量低浓度睾酮的样品，-20℃保存。用称重法制备校准曲线，吸取相应标准品、内标工作液（0.25 μg/g）混合，使得校准曲线4个点标准品与内标质量比接近0.75、0.90、1.05、1.20，记录每次吸取工作液的准确质量。

1.4 性能评价

参照CLSI EP15-A3文件[12]和C62-A文件[13]，对改良方法的精密度、准确度、定量限等性能指标进行验证。

1.4.1 精密度 以本法测定2022RELA比对样本，共测定4 d，每天不同浓度的样本各处理3个，每个重复测定3次，最后计算样本的天内和天间变异系数(coefficient of variation，CV)。

1.4.2 准确度 用本法测定有证参考物质SRM971a（Male/Female）来评价准确度。同时参加2022年国际临床化学会组织的国际参考实验室室间质量评价（RELA比对）来进一步验证本法与其他实验室的等效性。

1.4.3 定量限 计算上述准确度验证用参考物质SRM971a（Female）的信噪比（S/N）均值，按比例稀释至信噪比约为10∶1，上机检测，将信噪比10∶1的实测值作为定量限。

1.4.4 线性范围 向已知低浓度的血清（0.151 ng/ml）中添加高浓度睾酮标准品储备液，共配制成7个浓度点（0.151、0.571、2.399、5.369、9.513、12.462、17.260 ng/ml），每个浓度点处理3个平行，上机重复检测3次。以理论值为X轴，实测值为Y轴拟合回归方程。R值应≥0.9900[14]。

1.4.5 干扰研究 对可能的测定干扰物（表睾酮、去氢表雄酮）进行分析，验证对睾酮测量的影响。

1.5 临床常规检测方法溯源评价

参考GB/T 21415-2020 ISO 17511文件[15]，使用改良的参考方法对司内睾酮试剂盒（CLIA）的标准品、校准品赋值、传递，进行溯源。溯源后检测参考物质SRM971a（Male）来验证溯源的准确性。

1.6 不确定度初步评定

依据CNAS-GL006文件[16]采用自上而下（Top-Down）的方法来评估不确定度。经评估，本法不确定度主要来自样本的重复测量（A类不确定度），标准溶液配制、睾酮标准品纯度、校准溶液称量、待测样本及内标称量（B类不确定度）等过程等引入的。

1.7 统计学处理

采用包括法计算血清睾酮浓度，用Analyst 1.5.2、Excel 2016软件进行统计分析。

2 结果

2.1 方法建立及方法学评价

2.1.1 精密度 ID LC-MS/MS法检测2022 RELA样本的数据见表1，2022 RELA-A的天（批）内CV≤2.30%，天（批）间CV≤2.49%，2022 RELA-B的天（批）内CV≤1.25%，天（批）间CV≤1.60%。

2.1.2 准确度 本法测定有证参考物质SRM971a（Male）、SRM971a（Female）的结果与认证值的偏移分别为1.52%及1.45%，见表2。在2022年RELA比对中，本实验室（编号205）顺利通过（等效限要求±8.75%，http: //www.dgkl—rfb.de: 81/index.shtml）。

表2 ID LC-MS/MS法测定睾酮参考物质

2.1.3 定量限 测定有证参考物质SRM971a（Female）的信噪比均值为51，稀释4倍后上机，重复测定10次，计算信噪比均值为9.7，方法的定量限定为0.08 ng/ml。

2.1.4 线性范围 在0.151～17.260 ng/ml范围内，以理论值为横坐标，实测值为纵坐标作图，见图1。标准曲线的线性方程为Y=1.0143X-0.0342，R2=0.9993，实测值与理论值的相关性良好。方法的线性范围定为0.151～17.260 ng/ml。

图1 ID LC-MS/MS法检测血清睾酮的线性范围

2.1.5 干扰研究 对可能影响睾酮准确测定的干扰物质（包括与睾酮有相同MRM转变的表睾酮与睾酮有相同分子质量的去氢表雄酮）进行分析。结果表明，睾酮、表睾酮具有相同的分子量，但在此液相条件下，两者可完全分离（图2）。

图2 睾酮与表睾酮的质谱扫描色谱结果

2.2 司内临床常规检测方法（CLIA法）溯源及评价

采用该方法对司内睾酮检测试剂盒（CLIA）的标准品、校准品进行定值、溯源，溯源前后检测参考物质SRM971a（Male）的数据见表3。溯源后与参考物质SRM971a（Male）偏差3.86%，溯源前偏差10.26%。

表3 溯源前后司内睾酮试剂盒检测参考物质

2.3 不确定度评定

对2022 RELA-A、2022 RELA-B的不确定度进行评定。A类评定是由实验测量得到被测量的值计算得来，B类评定则是通过已知信息如校准证书、检定证书计算而来。经评估，本法测定2022 RELA-A、2022 RELA-B的浓度分别为6.60、14.03 ng/ml，扩展不确定度分别为0.22、0.27 ng/ml（包含因子k=2）。

3 讨论

JCTLM列表里血清睾酮液相色谱串联质谱参考方法相对于气相色谱串联质谱参考方法来说样本前处理过程简单。液相色谱质谱参考方法中新加坡HSA参考方法前处理过程相对美国CDC及美国NIST的参考方法又更简单，但流动相采用等度洗脱，针对液质仪器来说样本分离度不是很理想。本实验室在HSA参考方法的基础上，流动相采用梯度洗脱，样本分离度变好，色谱峰峰型良好对称，无多余杂峰；质谱参数也进行了优化，建立了适合本实验室的参考方法。

本研究考察了可能影响睾酮浓度测定的干扰物质的分离情况，其中表睾酮与睾酮在优化的色谱条件下可以完全分离，这与张天娇等[17]的研究结果一致。去氢表雄酮与睾酮虽然有完全相同的分子量，但在保留时间处响应很低，峰面积约是睾酮的1/100，对睾酮浓度测定基本无影响。本研究只针对两种睾酮干扰物（表睾酮、去氢表雄酮）进行了研究验证，其他如雄酮、α-雌二醇、葡糖苷酸睾酮等未进行验证，后续需要继续研究验证。

司内睾酮临床常规检测试剂（CLIA法）溯源前后检测参考物质结果显示，溯源前检测参考物质与认证值偏倚10.26%，可见溯源前检测睾酮并不是很准确，溯源后检测参考物质偏倚3.86%，溯源后试剂准确性大大提高。本研究不足之处在于未对溯源前后的试剂检测新鲜血清进行考察，只对参考物质进行了考察。但有证参考物质被认为是具有互换性的，可以证明血清检测准确性也有所提高。

综上所述，本研究在JCTLM公布的新加坡HSA血清睾酮的参考方法基础上进一步改良。改良后的方法操作简便、分析时间短，且准确度、精密度均良好。采用该方法为临床常规检测方法（CLIA法）溯源后，检测参考物质准确性有了很大的提高，为临床准确检测血清睾酮发挥积极作用。