郝志慧 连 薇 代前龙 何 飞

大理大学基础医学院 云南省高校细胞生物学重点实验室，云南大理 671000

乳腺癌是一类由于基因突变、激素紊乱等多种原因导致乳腺上皮细胞发生癌变的恶性肿瘤。三阴性乳腺癌作为乳腺癌的一种病理亚型，具有预后差、高侵袭性、高转移性和高复发率的临床特征。

澳洲茄碱是一种甾体生物碱，从天然草本植物龙葵中提取，具有广泛的抗肿瘤、抗氧化和抗炎特性。研究证实澳洲茄碱具有治疗糖尿病肾病足细胞损伤的潜力[1]，并可以通过激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）/叉头框转录因子3a（forkhead box 3a，FoxO3a）信号通路减轻七氟醚诱导的神经毒性[2]。国内外对于澳洲茄碱与肿瘤相关的研究表明，澳洲茄碱在胰腺癌[3]、肺腺癌[4]、膀胱癌[5]、急性单核细胞白血病[6]、肝细胞癌[7-8]、胃癌[9-10]、神经胶质瘤[11]的治疗中有效。但目前尚未报道对于澳洲茄碱在乳腺癌特别是三阴性乳腺癌中的作用研究。

本研究旨在证实澳洲茄碱对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的生长抑制作用，并探索其作用机制。为临床上三阴性乳腺癌的治疗提供新的药物应用方案，具有重要的应用参考价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料

MDA-MB-468人乳腺癌细胞（CL-0290B）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；澳洲茄碱（SS8630）购自北京索莱宝科技有限公司，溶解于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），首次配制成10 mmol/L浓度，后续实验依据所需药物浓度进行稀释。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和处理 MDA-MB-468人乳腺癌细胞用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和1%双抗的DMEM高糖培养基，于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行培养。

1.2.2 CCK-8法检测澳洲茄碱对MDA-MB-468细胞活力的影响 将细胞以2000个/孔的浓度均匀种植到96孔板中过夜培养，分别用浓度为0、10、20、30、40、50 μmol/L的澳洲茄碱进行处理，另一对照组用0.3%DMSO处理，培养至24、48 h。加入CCK-8培养2 h后测定其450 nm处吸光度，分析不同处理时间和不同药物浓度作用下的细胞增殖能力及细胞活力。细胞活力＝（A药物-A空白）/（A对照-A空白）。A药物：药物处理组吸光度，A空白：空白组吸光度，A对照：对照组吸光度。

1.2.3 划痕实验观察澳洲茄碱对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞迁移能力的影响 将细胞以2×105个/孔的浓度均匀种植到6孔板中。用10 μl枪头直线划伤单层细胞，形成均匀划痕。用上述不同浓度的澳洲茄碱处理，分别于24、48 h在显微镜下拍摄细胞发生运动迁移的情况，并用Image J测量两边缘细胞之间的距离。

1.2.4 克隆形成实验检测澳洲茄碱对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞克隆形成能力的影响 将细胞以1000个细胞/孔的浓度接种于6孔板中。用不同浓度的澳洲茄碱分别处理24、48 h后换液，培养7 d（中间每2～3天换液）。用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染液染色。用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤细胞数次，晾干后于显微镜下拍照。

1.2.5 Western blotting检测三阴性乳腺癌MDAMB-468细胞中磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路相关蛋白及P53蛋白的表达水平 分别用含药物浓度0、40、50 μmol/L的培养基处理细胞，24 h后提取细胞总蛋白。使用10%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）凝胶进行蛋白电泳。应用超敏ECL化学发光试剂盒显色。Image J分析各个条带的灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参灰度值。

1.3 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（）表示，两两比较采用Graphpad Prism软件进行t检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 澳洲茄碱对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞活力的影响

CCK-8法检测结果显示，与对照组比较，不同浓度的澳洲茄碱均可抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖、降低细胞活力，差异有统计学意义（P< 0.05），且其抑制作用具有浓度依赖性，见图1。

图1 澳洲茄碱对三阴性乳腺癌MDAMB-468细胞活力的影响（，n=3）

2.2 澳洲茄碱对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468运动迁移能力的影响

划痕实验结果显示，与对照组比较，不同浓度的澳洲茄碱均可抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞迁移运动能力。其形态学结果观察以及划痕愈合率数据对比分析显示，与对照组比较，澳洲茄碱40、50 μmol/L的处理组划痕愈合率上具有显著差异，见图2。

图2 澳洲茄碱对MDA-MB-468细胞迁移的影响（，n=3）

2.3 澳洲茄碱对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468克隆形成能力的作用

对细胞克隆形成实验显微镜下结果观察可知：与对照组比较，不同浓度的澳洲茄碱均可减弱三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的克隆形成能力。且高浓度处理组（40、50 μmol/L）具有显著差异，见图3。

图3 澳洲茄碱对MDA-MB-468细胞克隆形成能力的影响

2.4 澳洲茄碱对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的PI3K-AKT信号通路相关蛋白表达量的影响

形态学实验结果均提示高浓度（40、50 μmol/L）澳洲茄碱对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468抑制作用显著。Western blotting检测结果显示澳洲茄碱可下调PI3K-AKT通路相关蛋白PI3K、AKT的表达量（P< 0.05），见图4。

图4 澳洲茄碱对MDA-MB-468细胞中PI3K、AKT蛋白表达的影响（，n=3）

2.5 澳洲茄碱对三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的P53抑癌基因蛋白表达量的影响

对细胞的药物处理方法及蛋白提取流程同PI3K-AKT通路相关蛋白。结果显示澳洲茄碱可以下调MDA-MB-468细胞P53蛋白的表达量（P< 0.05），见图5。

图5 澳洲茄碱对MDA-MB-468细胞中P53蛋白表达的影响（，n=3）

3 讨论

澳洲茄碱是一类糖苷生物碱，近年来被应用于抗肿瘤的研究。研究发现，澳洲茄碱可引起胰腺癌细胞[3]和肺腺癌细胞[4]中的铁死亡；可诱导细胞周期停滞影响膀胱癌细胞的活力[5]；可上调AMPK/FoxO3a通路抑制急性单核细胞白血病的体外和体内进展[6]；可通过miR-375-3p和lncRNA CCAT1之间的相互调控抑制肝细胞癌HepG2的生长[7]。目前关于澳洲茄碱对三阴性乳腺癌作用的研究未见报道，考虑到其广泛的抗肿瘤作用，因此研究了其对三阴性乳腺癌的生长抑制作用及其相关作用机制。

PI3K-AKT信号通路在细胞代谢、细胞生长、细胞增殖、细胞凋亡和血管生成等基本细胞活动中起主要作用，并在多种肿瘤中存在异常激活。高聚伟等[12]基于网络药理学探讨了澳洲茄碱的抗肿瘤机制，发现澳洲茄碱具有“多靶点-多通路”作用机制，参与多个生物学过程和信号通路，其中PI3K-AKT是其核心信号通路之一。基于该通路在细胞活动中的广泛作用及其在肿瘤细胞中的重要影响，本研究首先应用不同浓度的澳洲茄碱处理MDA-MB-468细胞，分别对药物处理24、48 h的细胞进行了CCK-8检测、划痕实验和克隆形成实验，后续应用Western blotting分子实验对该通路相关蛋白表达量进行验证。细胞实验结果发现与对照组比较，澳洲茄碱可显著降低MDA-MB-468细胞的增殖和运动迁移能力，抑制细胞的克隆形成能力。高浓度组（>40 μmol/L）较低浓度组（10 μmol/L）的抑制效果更加显著，证实了澳洲茄碱的抑癌效果具有浓度依赖性。

在澳洲茄碱对于其他肿瘤的作用研究中，Liang等[3]的研究采用了50 μmol/L的澳洲茄碱，对两种胰腺癌细胞系（PANC-1、CFPAC-1）进行了克隆形成实验和Transwell，结果证实在该浓度下的澳洲茄碱能够抑制细胞的克隆形成和迁移能力。Li等[9]研究应用同样方法检测了澳洲茄碱对SGC-7901胃癌细胞增殖的作用，发现澳洲茄碱以剂量依赖性方式显著抑制了SGC-7901细胞的体外增殖。Zhang等[10]研究应用克隆形成实验证实了澳洲茄碱可抑制胃癌细胞增殖并降低其克隆形成能力。Wang等[11]研究证实澳洲茄碱可以抑制神经胶质瘤细胞的迁移和克隆形成，抑制胶质瘤的生长。在乳腺癌中，PI3K突变和AKT激活将导致激素治疗耐药性[13]。Ma等[14]研究发现KAT7通过上调PI3KAKT信号通路促进乳腺癌的放射耐药性。在中药与肿瘤治疗的研究中，郭利培等[15]研究发现中药成分吴茱萸碱可能通过抑制PI3K-AKT信号通路活性来抑制鼻咽癌细胞增殖。刘楠等[16]研究验证了红花多糖能够显著降低MDA-MB-435细胞中PI3K、AKT蛋白的表达水平，有效抑制细胞生长和促进凋亡。本研究同样验证了澳洲茄碱对MDAMB-468细胞中PI3K-AKT通路的作用，结果显示PI3K和AKT蛋白的表达量均受到显著抑制。

P53是一种抑癌基因，Pham等[8]研究表明澳洲茄碱可通过P53依赖性途径和P53非依赖性途径诱导肝细胞癌HCC细胞系的凋亡。P53基因在乳腺癌中呈高表达，与乳腺癌患者病理分期、组织学分级等病理特征呈正相关。本研究结果显示澳洲茄碱能够显著抑制P53蛋白的表达，且50 μmol/L处理组的抑制作用较40 μmol/L更加明显，有剂量相关性。

综上所述，本研究证实了澳洲茄碱能够抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-468细胞的增殖、运动迁移和克隆形成能力，并初步验证了澳洲茄碱抗三阴性乳腺癌的作用机制可能与抑制PI3K-AKT信号通路及降低P53蛋白的表达水平有关。在后续的研究中仍需进一步验证：澳洲茄碱与PI3K-AKT通路抑制剂以及铂类肿瘤化疗药物联合应用是否能够起到协同促进作用。从而在更少的药物用量和更低的化疗副作用下产生有效的抗癌效果，为将来澳洲茄碱可能应用于乳腺癌的临床治疗提供理论参考。