肖梦圆　李平兰　武瑞赟

摘 要：为确定获得软骨素裂解酶产生菌的分类地位及提高菌株产酶水平，通过形态学和16S rRNA基因序列分析鉴定菌株PL-410，并采用单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken响应面试验优化菌株PL-410的产酶条件。结果表明，菌株PL-410为假节杆菌属（Pseudarthrobacter sp.），命名为假节杆菌PL-410；优化的最佳培养基为牛软骨硫酸软骨素添加量7.5 g/L、胰蛋白胨添加量2.5 g/L、NaCl添加量5 g/L、KH2PO4添加量

0.3 g/L、培养基初始pH 6.53，最佳发酵条件为接种量2.98%、摇瓶装液量8%、摇床转速160 r/min、发酵温度24 ℃、发酵时间27.63 h，在此条件下软骨素裂解酶的活力（2 531.765 U/L）比优化前（85.229 U/L）提高28.7 倍，可更有效地降解牛软骨硫酸软骨素。

关键词：假节杆菌；软骨素裂解酶；产酶条件优化

Optimization of Fermentation Conditions for Chondroitinase Production by Pseudarthrobacter sp. PL-410

XIAO Mengyuan1， LI Pinglan1， WU Ruiyun1，2，*

（1. College of Food Science and Nutritional Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China;

2. Integrated Laboratory of Processing Technology for Chinese Meat and Dish Products， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Food Science and Technology， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract： In order to determine its taxonomic status and to improve its enzyme production level， the chondroitinase-producing strain PL-410 was identified based on morphology and 16S rRNA gene sequence analysis， and the fermentation conditions for chondroitinase production by this strain were optimized by single factor experiments， Plackett-Burman design， the steepest ascent method and Box-Behnken design combined with response surface methodology. The results showed that the strain PL-410 was identified as Pseudarthrobacter sp. The optimal medium was composed of chondroitin sulfate from bovine cartilage 7.5 g/L， tryptone 2.5 g/L， NaCl 5 g/L， KH2PO4 0.3 g/L， and initial pH 6.53. The optimal fermentation conditions were as follows： inoculum volume 2.98%， medium volume in shaking flasks 8%， shaker rotation speed 160 r/min，

fermentation temperature 24 ℃， and fermentation time 27.63 h. The chondroitinase activity under these conditions was

2 531.765 U/L， which was 29.7 times higher than that before optimization （85.229 U/L）.

Keywords： Pseudarthrobacter sp.; chondroitinase; optimization of enzyme production conditions

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070

中圖分类号：TS201.3                                      文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2023）09-0021-09

引文格式：

肖梦圆， 李平兰， 武瑞赟， 等. 假节杆菌PL-410产软骨素裂解酶制备条件优化[J]. 肉类研究， 2023， 37（9）： 21-29. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070.    http：//www.rlyj.net.cn

XIAO Mengyuan， LI Pinglan， WU Ruiyun， et al. Optimization of fermentation conditions for chondroitinase production by Pseudarthrobacter sp. PL-410[J]. Meat Research， 2023， 37（9）： 21-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20230714-070.    http：//www.rlyj.net.cn

硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一类以

D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖胺通过β-1，3糖苷键连接为基本二糖单位的线性多糖，二糖单位之間通过β-1，4糖苷键连接，分子质量为50～100 kDa[1]。CS广泛存在于哺乳动物中，在骨骼、软骨、皮肤、肌腱、脐带和血管中含量丰富[2]。CS通常与核心蛋白共价连接，形成不同生理功能的蛋白聚糖[3]，还可以通过与各种关键元素（如生长因子、细胞因子、趋化因子、黏附因子和脂蛋白）相互作用调节生命过程[4]。因此，CS具有多种生物活性，包括抗氧化、抗动脉粥状硬化、抗血栓、抗炎、抗肿瘤、调节免疫等[5-7]。但由于其分子质量大、表观黏度高、水溶性低，难以通过肠黏膜、胃黏膜等生理黏膜，导致其生物利用率较低，限制其生物活性的发挥[8]。低分子质量CS（低于10 kDa）具有黏度低、水溶性高、易吸收等优点，生物利用率提高，可有效发挥其生物活性[9]。

软骨素裂解酶（chondroitinase，Chase）是一类可降解CS的裂解酶，通过β-消除机制作用于CS多糖链的β-1，4糖苷键，形成在232 nm波长处有吸收的C4＝C5双键的不饱和寡糖和二糖[10]。Chase可用来制备高生物活性的低分子质量CS，酶解过程无污染，反应条件温和，催化效率高，且获得的低分子质量CS的分子质量

可控[11]。Chase也可用于构建寡糖文库，研究CS的结构、二糖组成、确定来源及检测含量[12]；此外，Chase本身具有广泛的应用价值，如修复脊髓损伤[13]、减轻腰椎间盘突出[14]、治疗瘢痕疙瘩[15]、抑制肿瘤发展[16]、治疗弱视[17]等。因此，制备高纯度、高活力的Chase具有广阔的前景。微生物是Chase的来源，目前已筛选出多株产Chase的菌株，包括普通变形杆菌NCTC4636[18]、肝素黄杆菌ATCC13125[19]、多形拟杆菌ATCC29148[20]、弧菌FC509[21]、温和气单胞菌YH311[22]、黏质沙雷氏菌GT596[23]、节杆菌MAT3885[24]等。虽然产Chase菌株众多，但由于低酶活力的瓶颈制约，不能满足工业化生产需求。

本研究从土壤中筛选、分离、鉴定得到一株产Chase的假节杆菌（Pseudarthrobacter sp.），通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken响应面试验对假节杆菌产Chase的发酵培养基和发酵条件进行优化，提高产酶水平，为Chase的工业生产和应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株PL-410分离自河边潮湿土壤中；牛软骨CS

曲阜圣嘉德生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、（NH4）2SO4、MgSO4（均为分析纯） 西陇科学股份有限公司；可溶性淀粉、NaCl、KH2PO4、浓盐酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；牛肉膏、胰蛋白胨 北京奥博星生物技术有限责任公司；酵母浸粉

英国Oxoid公司；牛肉浸粉 安琪酵母股份有限公司；CS-A（高纯，98%） 上海源叶生物科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris） 宝如亿（北京）生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 天根生物科技有限公司；戊二醛固定液（电镜专用，2.5%） 北京索莱宝科技有限公司。

LB培养基（种子培养基）：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.2。

基础发酵培养基：NaCl 5 g/L、KH2PO4 0.3 g/L、MgSO4 2 g/L、牛软骨CS 5 g/L、酵母浸粉10 g/L，pH 7.0。

1.2 仪器与设备

XSZ-HS3生物显微镜 重庆光电仪器有限公司；ML54/02电子天平、FE28 pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；UV-1800紫外-可见分光光度计

上海美谱达仪器有限公司；IMJ-85A高压灭菌锅 施都

凯仪器设备（上海）有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台

苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；DK-8B电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；3K15台式高速冷冻离心机 德国Sigma公司；MQD-S3R振荡培养箱 上海旻泉仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鉴定

1.3.1.1 形态学观察

挑取菌株PL-410于LB培养基平板上划线，30 ℃倒置培养72 h，观察菌株的菌落形态，并进行革兰氏染色。挑取菌株PL-410于LB液体培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养。取培养时间为12、48、72 h的菌液，离心后弃上清液，向菌体中加入戊二醛固定液，于4 ℃固定2 h，利用扫描电镜观察菌体的形态特征。

1.3.1.2 16S rRNA基因分析

挑取菌株PL-410于LB液体培养基中，30 ℃、

200 r/min振荡培养18 h。吸取菌液，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书，提取菌株的基因组DNA，由北京诺赛基因组研究中心有限公司对菌株PL-410的16S rRNA基因进行测序。测序结果提交至NCBI Genbank数据库，与数据库中已知菌株的16S rRNA基因序列进行比对，并利用MEGA 6.0软件构建系统发育树。

1.3.2 种子液培养

挑取假节杆菌PL-410单菌落，接种于种子培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养至OD600 nm为0.6左右（菌体数约为6×108 CFU/mL），制得种子液。

1.3.3 单因素试验

在基础发酵培养基的基础上，分别考察碳源种类（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和牛软骨CS）、碳源添加量（0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g/L）、氮源种类（牛肉膏、胰蛋白胨、酵母浸粉和牛肉浸粉）、氮源添加量（5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0 g/L）、MgSO4添加量（0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）、培养基初始pH（pH 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接种量（0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0%）、摇瓶装液量（10%、20%、25%、30%、40%、50%）、发酵温度（23、26、28、30、32 ℃）和发酵时间（0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48 h）对假节杆菌PL-410产Chase的影响。通过单因素试验结果，选择Plackett-Burman试验的影响因素和水平。

1.3.4 Plackett-Burman试验

根据上述单因素试验结果，选取7 个因素，每个因素取高低两个水平，利用Design-Expert 11.0软件设计Plackett-Burman试验，试验次数选择Run=12，以Chase活力为响应值。通过比较各因素的显著性水平，筛选出对Chase活力影响比较显著的3 个因素，具体设计的试验因素和水平如表1所示。

1.3.5 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman试验分析的因素显著性及效应值，设计最陡爬坡试验的变化方向和步长。若不显著（P＞0.05）因素的效应值为正，则该因素取高水平值，若效应值为负，则该因素取低水平值。具体试验设计如表2所示。

根据最陡爬坡试验结果，确定Box-Behnken响应面试验的中心点与响应区间，利用Design-Expert 11.0软件设计Box-Behnken响应面试验，以Chase活力为响应值，进行17 组试验，具体试验设计如表3所示。模型对Chase活力进行二次多元回归拟合，生成响应面曲线图和等高线图，获得最佳发酵参数。并在最佳发酵参数下进行验证，比较试验值与模型预测值，验证模型的可靠性。

1.3.7 Chase活力测定

发酵结束后，取发酵液1 mL，4 ℃、8 000 r/min离心5 min，取上清液弃沉淀。参考Fu Jingyun等[25]的方法，测定发酵上清液中Chase活力。Chase活力单位的定义为：在37 ℃条件下，每分钟降解CS产生1 μmol不饱和二糖所需的酶量。

1.4 数据处理

每组试验设置3 个重复，计算平均值和标准差，利用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，并利用Origin 2019b软件作图。Plackett-Burman试验和响应面試验通过Design-Expert 11.0软件设计和分析处理。

2 结果与分析

2.1 软骨素裂解酶产生菌的分类鉴定

2.1.1 形态学观察

如图1a所示，菌株PL-410在LB固体培养基30 ℃培养72 h后，形成直径1～2 mm的圆形菌落，菌落中心凸起，表面光滑，边缘较规则，不透明，呈乳白色。如

图1b所示，革兰氏染色观察菌株PL-410菌体呈现紫色，为革兰氏阳性菌。如图2所示，在LB液体培养基中，菌株PL-410在生长过程中的形状会经历一个“杆-球”形状的变化。培养时间为12 h时，菌体长1.4～3.0 μm，呈细长、不规则的杆状（图2a）；培养时间为48 h时，菌体长0.5～1.5 μm，杆状细胞缩短，菌体短小，近于椭圆形（图2b）；培养时间为72 h时，菌体长0.5～1.0 μm，菌体细胞进一步缩短，近于球形（图2c）。随着培养时间的延长，菌株生长所需的营养物质愈发匮乏，同时累积大量代谢产物造成恶劣的生长环境。菌体由杆状转化为球状，有助于其在恶劣环境中生存，因为球状细胞呈休眠状态，对逆境具有极强的耐受能力[26]。

2.1.2 16S rRNA基因序列分析和系统发育树构建

使用NCBI网站的BLASTn对菌株PL-410的16S rRNA基因序列进行在线分析，比对结果显示菌株PL-410与假节杆菌属（Pseudarthrobacter sp.）的序列高度一致。基于菌株PL-410的16S rRNA基因序列及其同源性序列，利用MEGA 6.0软件构建系统发育树，如图3所示。综合形态学和16S rRNA基因序列同源性分析，确定菌株PL-410属于假节杆菌属，命名为假节杆菌PL-410。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 培养基成分对假节杆菌PL-410产酶能力的影响

由图4A可知，在葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉为碳源时，假节杆菌PL-410产Chase的水平较低，和不添加碳源（对照）组的产酶水平没有显著差异；当牛软骨CS为碳源时，假节杆菌PL-410的产酶水平最高，达到85.229 U/L，

显著高于其他组（P＜0.05）。这可能是因为Chase为一种诱导酶，只有当生长环境中有诱导物（CS）存在时才能生成，CS胁迫假节杆菌PL-410产生Chase，降解利用CS满足自身的生长[27]。故以牛软骨CS为碳源研究碳源添加量对假节杆菌PL-410产酶能力的影响。如图4B所示，牛软骨CS添加量由0 g/L增加到5.0 g/L时，菌株产酶水平逐渐升高，其中添加量为5.0 g/L时，产酶水平最高，为114.510 U/L。当牛软骨CS添加量继续增加时，菌株产酶水平缓慢下降。这可能是因为过多碳源导致菌株前期快速生长，累积大量毒性因子等代谢产物，造成恶劣的培养基环境，使Chase丧失部分酶活力，导致Chase活力降低。根据以上结果确定牛软骨CS添加量为2.5～7.5 g/L为Plackett-Burman试验的因素水平。

由图4C可知，胰蛋白胨和酵母浸粉更能促进假节杆菌PL-410产生Chase，其中当胰蛋白胨为氮源时，菌株的产酶水平最高，为191.111 U/L。故选择胰蛋白胨为氮源，探究氮源添加量对假节杆菌PL-410产酶能力的影响。如图4D所示，胰蛋白胨添加量为5.0～15.0 g/L时，菌株的产酶水平没有显著差异；当胰蛋白胨添加量高于15.0 g/L时，菌株的产酶能力下降，这可能是因为过多胰蛋白胨诱导菌株产生蛋白酶降解Chase。胰蛋白胨添加量为5.0 g/L时，菌株的产酶水平最高，为238.431 U/L，故确定胰蛋白胨添加量2.5～7.5 g/L为Plackett-Burman试验的因素水平。

由图4E可知，Mg2＋添加量对菌株产酶水平影响不显著，可能是因为胰蛋白胨中存在的微量Mg2＋可以满足假节杆菌PL-410生长代谢，无需额外添加Mg2＋。因此

Mg2＋添加量不作为Plackett-Burman试验的影响因素，选择不添加Mg2＋继续后续实验。由图4F可知，随着培养基初始pH值由酸性向碱性变化，菌株产酶水平先升高后下降，当培养基初始pH值为6.0时，菌株的产酶水平最高，为343.529 U/L。故选择培养基初始pH 5.5～6.5为Plackett-Burman试验的因素水平。

小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）。图5同。

2.2.2 发酵条件对假节杆菌PL-410产酶能力的影响

由图5A可知，随着接种量的增加，菌株的产酶水平先升高后下降。造成此现象的原因可能是过低的接种量会延长培养时间，而过高的接种量导致溶氧不足，从而影响Chase的合成。当接种量为1%～10%时，菌株的产酶水平较高，组间没有显著差异，从缩小成本的角度出发，选择接种量1%～3%为Plackett-Burman试验的因素水平。

由图5B可知，菌株产酶水平随着装液量的增加而降低。当装液量为10%时，菌株产酶水平最高（352.157 U/L），因为假节杆菌PL-410为需氧菌，装液量越少培养基溶氧越多，越有利于假节杆菌PL-410发酵产酶。故选择摇瓶装液量8%～12%为Plackett-Burman试验的因素水平。

由图5C可知，随着发酵温度的升高，菌株的产酶水平先升高后下降。当发酵温度为26～28 ℃时，菌株产酶水平最高，故选择发酵温度24～28 ℃为Plackett-Burman试验的因素水平。

由图5D可知，菌株培养8 h后，开始产生Chase，随后Chase产量迅速增加，在24 h达到最大值，Chase活力为1 660.588 U/L，表现出与菌株生长曲线相似的趋势；24 h后Chase产量无明显增加，因为24 h后培养基pH值从7.79逐渐升高到8.36，pH值升高改变了Chase活性中心构象，使Chase丧失部分活力。因此选择发酵时间20～28 h为Plackett-Burman试验的因素水平。

2.3 Plackett-Burman试验结果

Plackett-Burman試验是一种能够从众多影响因素中筛选出可信度大于95%主效应因素的试验方法。如表4所示，利用Design-Expert 11.0软件对Plackett-Burman试验结果进行效应分析和方差分析，结果如表5所示。模型方差P＜0.05，说明数据模型对试验结果有显著影响，试验结果具有可信度。牛软骨CS添加量（A）、培养基初始pH（C）、接种量（D）和发酵时间（G）这4 个因素为正效应，应增加；胰蛋白胨添加量（B）、摇瓶装液量（E）和发酵温度（F）这3 个因素为负效应，应减少。其中培养基初始pH（C）、接种量（D）与发酵时间（G）贡献率最高，P值均小于0.05，表明这3 个因素对假节杆菌PL-410产Chase的能力具有显著影响，因此选择这3 个因素进行最陡爬坡试验确定响应面试验的中心点。其余4 个因素则根据各自效应值进行取值，即选择牛软骨CS添加量7.5 g/L、胰蛋白胨添加量2.5 g/L、摇瓶装液量8%、发酵温度24 ℃。

2.4 最陡爬坡试验结果

如图6所示，随着培养基初始pH值的升高、接种量的增加和发酵时间的延长，Chase活力呈现先上升后下降的趋势。Chase活力在3号试验点出现最大值，此时培养基初始pH值为6.5、接种量为3%、发酵时间为28 h，Chase活力为2 301.373 U/L。最终确定该点为下一步

2.5 Box-Behnken响应面试验结果

Box-Behnken响应面试验结果如表6所示。利用Design-Expert 11.0软件对试验结果进行方差分析，（表7），回归模型显著（P=0.000 3），失拟项不显著（P=0.110 4），表明回归模型对试验结果具有极显著影响，且未知因素对结果影响较小，模型选择恰当；回归模型决定系数R2=0.963 2，表明模型的预测值与实测值之间具有较高相关性，拟合程度较好[28]；回归模型的信噪比为12.957 4，大于4，表明模型可信度高，模型可用。

利用回归模型对表6的试验结果进行拟合，得到假节杆菌PL-410的Chase活力对培养基初始pH值（A）、接种量（B）和发酵时间（C）的多元二次回归方程：

Y=－56 745.89＋10 508.56A＋798.56B＋1 727.35C＋549.68AB＋133.44AC－14.29BC－1 212.99A2－669.24B2－46.26C2。

根据多元二次回归方程，绘制响应面试验的三维曲面图和等高线图。由图7可知，培养基初始pH值、接种量和发酵时间之间交互作用响应面较为陡峭，等高线椭圆程度较为明显，表明二者间交互作用对Chase活力的影响显著（P＜0.05）。等高线图呈圆形表明两因素间交互作用不显著，呈椭圆形表明两因素间交互作用显著，越“扁”交互作用越显著[29]。由图可以看出，培养基初始pH值和接种量间的等高线图相比之下更“扁”，表明这两者的交互作用对菌株产酶能力影响更显著。

利用Design-Expert 11.0软件分析计算，预测出最优参数分别为培养基初始pH 6.53、接种量2.98%、发酵时间27.63 h，此时预测假节杆菌PL-410的Chase活力为2 598.77 U/L。在上述最优参数下进行验证试验，实际测得Chase活力为（2 531.765±52.373）U/L，与预测值拟合度达97.4%，表明优化模型可靠。优化后假节杆菌PL-410的Chase活力（2 531.765 U/L）比优化前（85.229 U/L）

提高28.7 倍，说明本试验优化的培养基和发酵条件显著提高了Chase的产量。

刘万顺等[30]从土壤中筛选的少动鞘氨醇单胞菌产Chase活力最高为1 200 U/L（发酵周期36 h）；苏昕等[31]利用温和气单胞菌YH311产Chase活力最高为920 U/L（发酵周期36 h）；陶科等[32]从土壤中筛选的彭氏变形杆菌产Chase活力最高为322 U/L（发酵周期10 h）。相比之下，本研究筛选的假节杆菌PL-410具有酶活力较高、发酵周期较短的优势。

3 结 论

本研究分离鉴定了一株具有产Chase的假节杆菌属PL-410，并对产Chase条件进行优化，最终得到优化最佳培养条件为：最佳发酵培养基为牛软骨CS添加量7.5 g/L、

胰蛋白胨添加量2.5 g/L、NaCl添加量5 g/L、KH2PO4添加量0.3 g/L、培养基初始pH 6.53，最佳发酵条件为接种量2.98%、摇瓶装液量8%、摇床转速160 r/min、发酵温度24 ℃、发酵时间27.63 h。在此条件下Chase活力比优化前提高28.7 倍，优化效果显著，具有良好的开发应用前景。实验结果为假节杆菌PL-410工业化应用及Chase在工业、医药的应用提供良好的技术基础和支撑。但目前的研究处于初级阶段，要实现工业化大规模生产，还需进一步发酵工艺研究，酶的分离纯化工艺、酶学特性及酶的重组表达等也有待进一步研究。

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收稿日期：2023-07-14

基金项目：现代农业产业技术体系北京市渔业创新团队项目（BAIC07-2023-13）

第一作者简介：肖梦圆（1996—）（ORCID： 0000-0002-5641-8049），女，硕士研究生，研究方向为应用微生物。

E-mail： 15216605538@163.com

*通信作者简介：武瑞赟（1990—）（ORCID： 0000-0003-1030-4561），女，助理研究员，博士，研究方向为功能性益生元的理论与应用。E-mail： wuruiyun814@163.com