李文俊,王瑜芬

病毒性心肌炎是由病毒引起的原发性心肌炎症,会导致心脏生理功能发生改变,包括心肌泵送力降低和心律异常,其临床表现为非特异性,表现为乏力、呼吸急促、胸痛等,有时也表现出急性心力衰竭或室性心律失常等[1]。临床研究发现,病毒性心肌炎病理表现主要为心肌呈弥漫性、炎性病变[2]。有研究报道,病毒性心肌炎初始表现为急性期,经临床治疗后,病毒可被清除,但病毒感染介导的自身免疫性炎症可能持续存在,导致病人发展为心力衰竭,甚至病情急剧恶化导致病人死亡[3]。因此,早期诊断病毒性心肌炎对于该病治疗有十分重要的意义。近年来发现,非编码RNA,包括长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA),在疾病的病理变化中扮演关键角色[4]。母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)已被确定是心脏纤维化的诱导因子[5]。微小RNA-223(microRNA-223,miR-223)已被证实涉及心肌细胞肥大、心脏纤维化等不同心脏病理过程[6]。Xue等[7]研究发现,lncRNA MEG3在病毒性心肌炎小鼠心脏组织中由于可抑制M2巨噬细胞极化而加重炎症反应,此过程是通过下调miR-223表达来完成的。目前,lncRNA MEG3和miR-223在病毒性心肌炎病人中是否发挥同样作用尚鲜见报道。本研究拟探究lncRNA MEG3和miR-223在病毒性心肌炎病人血清中的表达情况并探讨其对病毒性心肌炎的诊断意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年9月—2021年9月本院收治的急性期病毒性心肌炎病人43例为病毒性心肌炎组,男25例,女18例,年龄20～42(32.05±6.53)岁。纳入标准:1)符合2001年版《关于成人急性病毒性心肌炎诊断参考标准》[8];2)入组前未接受激素治疗;3)病人及家属知情同意并签署知情同意书。排除标准:1)患有心源性休克者;2)患有先天性心脏病、心瓣膜病者;3)患有肺、肾、肝系统疾病或血液系统疾病者;4)患有其他恶性肿瘤者。选择同期在本院体检的46名健康者为对照组,男26名,女20名,年龄20～40(31.85±6.21)岁。病毒性心肌炎组、对照组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.2.1 样本采集

采集健康体检者体检当日和病毒性心肌炎病人入院检查时清晨空腹静脉血6 mL,离心(4 ℃,3 500 r/min,15 min),留上清,冻存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测血清中lncRNA MEG3和miR-223的mRNA表达

取上清液样本于冰上解冻,用北京索莱宝科技有限公司的总RNA提取试剂盒提取总血清RNA,用日本Takara公司的PrimeScript RT reagent Kit按照20 μL体系逆转录合成cDNA。美国ABI公司的7300 qRT-PCR仪对lncRNA MEG3和miR-223及内参β-actin、U6进行扩增反应。建立25 μL荧光反应体系,每组样本重复3次。反应条件:95 ℃,3 min;95 ℃,30 s;59 ℃,30 s;72 ℃,40 s;38个循环。采用2-ΔΔCt计算lncRNA MEG3和miR-223的mRNA相对表达量,引物购自上海吉玛合成。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 酶联免疫吸附法(ELISA)检测

用ELISA法检测血清中肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)及白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)水平,操作步骤依据美国Abcam公司的CK-MB、cTnI、IL-1β、IL-6 ELISA试剂盒说明书详细步骤执行。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组血清lncRNA MEG3、miR-223的mRNA水平比较

与对照组比较,病毒性心肌炎组血清lncRNA MEG3相对表达水平较高(P<0.05),miR-223相对表达水平较低(P<0.05)。详见表2。

表2 两组血清lncRNA MEG3、miR-223的mRNA水平比较

2.2 两组血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平比较

与对照组比较,病毒性心肌炎组血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平较高(P<0.05)。详见表3。

表3 两组血清cTnI、CK-MB、IL-1β、IL-6水平比较

2.3 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223的相关性分析

Pearson相关性分析显示,lncRNA MEG3与miR-223呈负相关(r=-0.647,P<0.05)。详见图1。

图1 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223相关性分析

2.4 病毒性心肌炎病人血清lncRNA MEG3、miR-223与IL-1β、IL-6的相关性分析

Pearson相关性分析显示,lncRNA MEG3与IL-1β、IL-6呈正相关(P<0.05),miR-223与IL-1β、IL-6呈负相关(P<0.05)。详见表4。

表4 血清lncRNA MEG3、miR-223与IL-1β、IL-6相关性分析

2.5 血清cTnI、CK-MB、lncRNA MEG3、miR-223表达诊断病毒性心肌炎的诊断价值

ROC曲线显示,cTnI、CK-MB诊断病毒性心肌炎的曲线下面积(area under curve,AUC)分别为0.782[95%CI(0.683,0.880)]、0.757[95%CI(0.653,0.862)],其敏感度分别为79.10%、76.70%,特异度分别为76.10%、73.90%;血清lncRNA MEG3诊断病毒性心肌炎的AUC为0.902[95%CI(0.841,0.963)],其敏感度、特异度分别为90.70%、76.10%;血清miR-223诊断病毒性心肌炎的AUC为0.790[95%CI(0.696,0.885)],其敏感度、特异度分别为88.40%、60.90%;lncRNA MEG3与miR-223联合诊断病毒性心肌炎的AUC为0.903[95%CI(0.841,0.966)],其敏感度、特异度分别为88.40%、82.60%,其中lncRNA MEG3与miR-223联合诊断的AUC值高于cTnI、CK-MB、miR-223单独诊断的AUC值(Z分别为2.056,2.377,1.977,P<0.05)。详见图2。

3 讨 论

病毒性心肌炎主要是由肠道病毒、上呼吸道病毒等侵入心脏引起免疫反应而造成心肌间质炎性细胞浸润的心肌炎性疾病[9]。随着环境污染加重,病毒性心肌炎的发病率也逐年上升[10]。目前,病毒性心肌炎诊断主要依据病毒感染史、临床特征、血清中心肌酶含量,但敏感性较低,临床上诊断病毒性心肌炎的金标准为内膜心肌活检,但疾病早期阶段很难获得准确的诊断[11]。当心肌细胞受到病毒等因素侵犯时,心肌组织受到损伤,心肌细胞中CK-MB、cTnI会迅速进入血液中,使血清中CK-MB、cTnI升高[12]。本研究显示病毒性心肌炎组血清cTnI、CK-MB水平较高于对照组,提示病毒性心肌炎病人存在心肌损伤。病毒性心肌炎病理变化为心肌细胞炎性浸润及坏死,有学者认为其与病毒持续性感染、炎症反应、免疫反应等有关[13]。另有研究显示,巨噬细胞极化在调节柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的病毒性心肌炎的心肌炎症中起着至关重要的作用,抑制CVB3感染引起的M1型巨噬细胞的活化,促进巨噬细胞向M2型极化发展,可改善病毒性心肌炎的心功能[14]。IL-1β、IL-6可由巨噬细胞和淋巴细胞产生,与机体炎症反应程度呈正相关[15]。本研究显示,病毒性心肌炎组血清IL-1β、IL-6水平明显升高,提示病毒性心肌炎病人体内存在炎症。

lncRNA MEG3可参与调控肿瘤细胞的增殖,目前发现,lncRNA MEG3可介导炎症性肠病的免疫炎性反应[16-17]。Xie等[18]研究显示,脑出血的大鼠脑组织中lncRNA MEG3表达水平明显上升,lncRNA MEG3高表达通过抑制miR181b表达促进脑出血引起的脑组织炎症反应。Li等[19]研究显示,在肺部细菌感染小鼠肺上皮细胞中,lncRNA MEG3通过促进IL-1β表达水平以促进肺部炎症反应。本研究显示,病毒性心肌炎组血清lncRNA MEG3相对表达水平高于对照组,且与IL-1β、IL-6呈正相关,提示lncRNA MEG3可能参与急性期病毒性心肌炎发生。综合上述研究推测lncRNA MEG3通过某种机制在急性期病毒性心肌炎中发挥促炎作用,影响急性期病毒性心肌炎的发生。miRNA可调控细胞增殖、凋亡及宿主-病原体反应等,不仅在维持心脏组织功能发挥关键作用,也可与不同靶点结合,调控病毒诱导的心肌炎中病毒的复制和病毒感染细胞的存活能力[20]。miR-223是先天免疫反应的调节剂,其表达失调会导致炎症性疾病[21]。miR-223是巨噬细胞极化和活化的有效调节剂。Yuan等[22]研究显示,miR-223高表达可通过直接靶向PBX/Knotted 1 Homeobox 1(Pknox1)促进巨噬细胞向M2型极化,降低肥胖小鼠体内炎症反应,但伴随着miR-223表达下降,其促使转录激活因子3(STAT3)蛋白表达水平增加,又导致IL-6表达增加,并放大炎症反应。Dang等[23]研究显示,miR-223过表达通过下调低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达显示出抗炎特性,阻止脂多糖诱导的M1型巨噬细胞极化,减轻败血症引起的小鼠心脏损伤。Zhang等[24]研究显示,结肠炎小鼠结肠组织miR-223上调会抑制IL-6/STAT3信号通路,降低IL-6表达水平,抑制结肠炎。本研究显示,病毒性心肌炎组血清miR-223相对表达水平低于对照组,且与IL-1β、IL-6呈负相关,提示miR-223可能参与急性期病毒性心肌炎发生。血清lncRNA MEG3联合miR-223诊断病毒性心肌炎的AUC为0.903,其敏感度、特异度分别为88.40%、82.60%,高于血清cTnI、CK-MB、miR-223诊断病毒性心肌炎的AUC,提示lncRNA MEG3联合miR-223对病毒性心肌炎具有较好的诊断价值,且优于血清cTnI、CK-MB指标。Zhang等[25]研究显示,lncRNA MEG3高表达促进血管内皮细胞炎症反应,并促进内皮功能障碍,其可作为miR-223内源性海绵来抑制miR-223表达,从而发挥促炎作用。本研究显示lncRNA MEG3与miR-223呈负相关,提示lncRNA MEG3可能与miR-223作用,共同影响急性期病毒性心肌炎的发生。

综上所述,病毒性心肌炎病人血清中lncRNA MEG3表达上调,miR-223表达下调,lncRNA MEG3与miR-223具有密切关系,且二者均与炎性因子相关,lncRNA MEG3联合miR-223对病毒性心肌炎具有较好的诊断价值。但本研究尚未探究lncRNA MEG3、miR-223与急性期病毒性心肌炎发生机制的关系,后续仍需深入探究。