李汶嘉,闫学丽,郑文玲,罗 丹,张 玮,孟恬宇

心力衰竭已成为一个日益严重的公共卫生问题,其流行率高、发病率高,需要住院治疗并重症监护,每年约有1 790万人死于心血管疾病,其中9.6%的人死于心力衰竭[1]。心力衰竭是各种心血管疾病的终末期,治疗措施包括药物治疗、心脏同步治疗以及心脏移植,主要集中于心力衰竭相关症状的控制[2]。通过这些治疗措施,心力衰竭的死亡率一定程度得以控制,但仍需寻找新的分子标志物以进一步降低心力衰竭病人死亡率及改善生活质量。

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA),包括微小RNA(micro RNA,miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和环形RNA(circular RNA,circRNA),在细胞和分子生理病理包括表观遗传、转录调控和转录后调控中发挥关键性作用[3]。越来越多的文献表明lncRNA广泛参与了心脏发育、动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压和动脉瘤的病理过程[4]。多项慢性心力衰竭(CHF)相关研究也报道了lncRNA表达失调,lncRNA MHRT在心力衰竭病人血浆中显著增加[5]。lncRNA LIPCA在心脏重塑过程中起作用,而且能够预测慢性心力衰竭病人的生存率[6]。lncRNA MALAT1在冠心病发展、严重程度和预后有关[7]。Hu等[8]提出通过有氧运动抑制慢性心力衰竭中的lncRNA MALAT1,从而改善心脏功能,其潜在机制可能通过miR-150-5p/磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路介导[8]。然而,诸多证据表明lncRNA可能不会独立执行调节功能,主要通过与某些ncRNA竞争性结合或海绵吸附miRNA,创建动态调控串扰网络,共同调控疾病发生发展[9]。

miRNA是天然的、内源性的非编码单链RNA分子,由约22个核苷酸组成,通过mRNA 的3′非翻译区与靶mRNA在转录后水平结合,从而进一步调节各种基因表达水平。近年来许多调控心脏形态的miRNA被鉴定出来,如miR-1和miR-133促进心肌细胞增殖,miR-15家族调节先天性心脏病的发展和再生[10-11]。Zhang等[12]提出miR-808通过调节转化生长因子-β1(TGF-β1)信号通路抑制心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡,有助于促进心肌细胞恢复活性。本研究通过采集慢性心力衰竭病人血清及健康人血清中lncRNA MALAT1和miR-808表达水平,分析其在心脏衰竭病人的临床意义,以期寻找新的生物标志物,为慢性心力衰竭临床治疗和诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

筛选2019年1月—2021年1月本院心血管内科收治的接受临床治疗的慢性心力衰竭病人120例,设为慢性心力衰竭组(观察组),其中男78例,女42例,年龄(64.72±8.11)岁,按照纽约心脏病协会(New York Heart Association,NYHA)制定的心功能分级标准,Ⅱ级42例,Ⅲ级50例,Ⅳ例28例。其中101例病因为冠心病导致的缺血性心肌病,19例为扩张型心肌病,97例合并原发性高血压。病例纳入标准:1)符合中华医学会心血管病分会制定的《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》中心力衰竭的诊断标准;2)NYHA心功能分级为Ⅱ～Ⅳ级,病程≥1年;3)与病人及家属容易沟通,可顺利跟进病情者。排除标准:1)患有先天性心脏病、心脏瓣膜病及心肌病等;2)其他器官功能不全、恶性肿瘤及代谢性疾病的病人;3)感染性疾病;4)免疫性相关疾病,如风湿等;5)孕妇、哺乳期妇女。选择同院同期参加健康体检者90名设为对照组,并排除了心脏结构和功能异常,其中男54名,女36名,年龄(63.01±7.79)岁。所有研究对象及其家属均了解本研究内容,并签署知情同意书。本研究内容经本院伦理委员会审核通过,符合《赫尔辛基宣言》内容。

1.2 方法

1.2.1 血清准备

观察组及对照组利用含抗凝剂的采血管于清晨空腹采集静脉血5 mL,并于4 ℃冷藏30 min后,室温下3 000 r/min,离心半径为10 cm,离心15 min,留取上层血清,置于-80 ℃ 冰箱备用。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)分析

根据血清试剂盒(Qiagen,德国)厂家说明,利用Trizol法提取血清中总RNA,并通过微量分光光度计分析总RNA纯度。利用RT-PCR试剂盒(Solarbio,中国)对RNA进行反向转录和扩增。lncRNA-MALAT1和miR-808引物由天根(北京)生物设计合成,以U6为内参,通过2-△△Ct法进行标准化,试验重复3次。RT-PCR引物序列为:lncRNA-MALAT1,正向:5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′,反向:5′-GGTCTGTGCTAGATC-3′;miR-808,正向:5′-TATTGCACTTGTCCCGGCCTGT-3′,反向:5′-CCGAGGCGGCCGACATGTTTC-3;U6,正向:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.3 超声心动图检查

应用彩色多普勒超声心动图仪(惠普5500型)检测,探头频率为2～4 HMz,计算观察组和对照组左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)。

1.2.4 分组

将慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1表达水平大于中位数(1.453)定为高表达病人,低于中位数定为低表达病人;血清miR-808表达水平大于中位数(0.820)定为高表达病人,低于中位数定为低表达病人。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组临床资料比较

观察组和对照组性别、年龄、心率、高血压和冠心病发病率以及心功能分级比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。详见表1。

表1 两组临床资料比较

2.2 血清lncRNA MALAT1和miR-808的mRNA表达水平

与对照组比较,观察组lncRNA MALAT1的mRNA表达升高(P<0.01),miR-808 mRNA表达水平降低(P<0.05)。详见图1。

图1 血清中lncRNA MALAT1和miR-808的mRNA相对表达水平

不同心功能级别慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1和miR-808的mRNA表达水平结果显示,心功能Ⅳ级病人血清lncRNA MALAT1 mRNA表达水平高于Ⅱ级和Ⅲ级病人,miR-808的mRNA表达水平低于心功能Ⅱ级和Ⅲ级病人(P<0.05),心功能Ⅲ级病人lncRNA MALAT1表达水平高于心功能Ⅱ级病人,miR-808的mRNA表达水平低于心功能Ⅱ级病人(P<0.05)。详见表2。

表2 观察组不同心功能分级病人血清lncRNA MALAT1和miR-808的RNA表达水平比较

2.3 lncRNA MALAT1和miR-808表达水平与心功能指标的相关性

Pearson相关性分析结果表明,慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1表达水平与LVEF呈负相关(r=-0.653,P<0.001),与LVEDD呈正相关(r=0.675,P<0.001)。慢性心力衰竭病人血清miR-808表达水平与LVEF呈正相关(r=0.721,P<0.001),与LVEDD呈负相关(r=-0.664,P<0.001)。详见图2。慢性心力衰竭病人血清中lncRNA MALAT1表达上调和miR-808表达下调可能与心功能降低有关。

图2 lncRNA MALAT1和miR-808表达水平与心功能指标的相关性分析

2.4 慢性心力衰竭风险因素分析

Logistic回归分析表明,心功能Ⅲ级或Ⅳ级、lncRNA MALAT1高表达和miR-808低表达是慢性心力衰竭独立危险因素,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

表3 Logistic回归分析慢性心力衰竭的危险因素

3 讨 论

心力衰竭是一种临床综合征,其特征是由于心室充盈和/或射血功能受损而出现的呼吸困难或活动受限[13]。慢性心力衰竭是持续存在的心力衰竭状态,早期诊断对慢性心力衰竭治疗有重要作用,治疗的重点是预防和逆转心肌重构以及心肌纤维化。因此,迫切需要寻找新的生物标志物以提高诊断准确性及治疗有效性。

lncRNA是一种新型的心脏发育和疾病分子调控因子,在塑造心脏结构和功能以及确定心血管疾病的发病机制方面起着重要作用。lncRNA MIAT诱导心肌纤维化,促进血管生成和炎性因子表达[14]。Liu等[15]研究发现,心肌细胞中含量丰富的lncRNA主要是调节导致心力衰竭代谢和病理生理过程,过表达可保护心脏,主要表现为改善收缩功能、保持代谢内稳态以及减弱心脏适应性不良的重塑反应。本研究结果发现,与对照组比较,慢性心力衰竭病人lncRNA MALAT1 mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05),而且随着心功能NYHA级别升高,lncRNA MALAT1 mRNA表达上调(P<0.05),进一步分析发现lncRNA MALAT1与LVEF呈负相关,与LVEDD呈正相关,结果提示lncRNA MALAT1 mRNA表达上调与心功能降低有关。

已有多项研究报道miRNA在心脏内环境稳定和疾病中的作用,miRNA调节途径参与心肌生理过程。在心肌组织中最为丰富的miRNA如miR-1和miR-133与成人心脏重塑、肥大和传导系统紊乱有关[16]。研究表明miRNA可能成为心血管治疗的潜在标志物,并且具有成为心脏疾病诊断工具的潜力[17]。Christian等[18]提出miR-499可作为心肌梗死生物标志物,其预测心肌梗死的能力与肌钙蛋白相似。miR-808可通过下调转化生长因子-β1(TGF-β1)表达,抑制心肌细胞凋亡以及促进心肌细胞存活[12]。本研究结果表明,与对照组比较,慢性心力衰竭病人血清中miR-808 mRNA表达水平降低(P<0.05),并且随心功能等级升高,miR-808 mRNA表达水平降低(P<0.05),miR-808 mRNA表达水平与LVEF呈正相关,与LVEDD呈负相关,慢性心力衰竭病人血清中miR-808 mRNA表达下调可能与心功能降低有关。Logistic回归分析表明,心功能分级Ⅲ级或Ⅳ级、lncRNA MALAT1高表达和miR-808低表达是慢性心力衰竭的独立危险因素(P<0.05)。因此,心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1和miR-808可能成为潜在诊断和治疗标志物,在慢性心力衰竭临床诊疗中具有一定参考意义。

本研究尚存在不足之处,通过分析慢性心力衰竭病人及对照人群血清中lncRNA MALT1和miR-808表达水平失调,但其具体分子作用机制未做深入分析,另外临床样本有限,后期研究过程中,将对此部分进一步剖析,以期证实lncRNA MALAT1和miR-808在心力衰竭诊疗中的临床意义。

综上所述,慢性心力衰竭病人血清lncRNA MALAT1表达水平升高,miR-808表达水平降低,这对慢性心力衰竭病人临床诊断及治疗具有一定指导意义。